DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 27.05.2008

Материалы

загрузка...

Кортиколиберин-зависимые механизмы постстрессовых депрессий у крыс

Миронова Вера Ивановна, 27.05.2008

 

Впервые обнаружено участие экстрагипоталамического звена CRH-системы в генезе модельной эндогенной депрессии. Показано увеличение экспрессии CRH в полях гиппокампа, осуществляющих торможение активности ГАС, у животных в модели эндогенной депрессии.

Впервые обнаружены общие и специфические закономерности динамики активности вазопрессинергической системы гипоталамуса при эндогенной депрессии и реактивном тревожно-депрессивном состоянии/ПТСР. Наряду со снижением содержания вазопрессина в гипоталамусе на 1-е сутки после экспозиции животных стрессу в обеих моделях выявлена специфичная для реактивного тревожно-депрессивного состояния активация синтеза вазопрессина в крупноклеточных ядрах гипоталамуса на поздних сроках его

Впервые проведено сравнительное исследование нейроэндокринных механизмов различных депрессивноподобных состояний, формирующихся в одних и тех же стрессорных условиях у крыс с генетически детерминированными противоположными стратегиями поведения. Эти исследования продемонстрировали наличие особенностей реактивности CRH-ергических центров мозга на стресс у активных (линия KHA) и пассивных особей (линия KLA). У пассивных животных обнаружено снижение экспрессии CRH в гипоталамусе и гиппокампе, но повышение – в неокортексе. У активных животных не обнаружено существенных изменений в гипоталамическом звене CRH-системы, но показана гиперактивация её экстрагипоталамического уровня (гиппокамп, неокортекс). У пассивных крыс при развитии тревожно-депрессивного состояния была выявлена гиперактивация крупноклеточной вазопрессинергической системы гипоталамуса, аналогичная описанной в модели ПТСР у крыс Вистар.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют современные представления о роли нейроэндокринной системы в патогенезе эндогенной и реактивной депрессии. Важное теоретическое значение для понимания механизмов патогенеза депрессий имеет основной вывод работы – о наличии как общих, так и специфических для разных форм депрессий нейроэндокринных механизмов формирования этих психопатологий.

Совокупность данных, свидетельствующая о ключевой патогенетической роли гиперактивации гипоталамического звена CRH-ергической системы при развитии разных форм депрессивных расстройств, имеет важное практическое значение. Установленные факты могут служить научной основой для разработки дифференциальных терапевтических стратегий коррекции различных форм депрессий в клинике. С их учетом возможно создание принципиально новых фармакологических средств, более эффективных за счет направленного действия не на общие нейрохимические, а на выявленные в данной работе специфические нейроэндокринные механизмы конкретной формы депрессии.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Международном междисциплинарном конгрессе «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Судак, Крым, Украина, 2004), III конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), VII Всероссийской конференции «Нейроэндокринология 2005» (Санкт-Петербург, 2005), XIV съезде психиатров России (Москва, 2005), Международном симпозиуме, посвящённом 80-летию организации Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы адаптивного поведения» (Санкт-Петербург, Колтуши, 2005), International Congress "Molecular basis of neurological and psychiatric disorders", organized in the frame of 11th meeting of Czech and Slovak Neurochemical Society (Martin, Slovak Republic, 2006), ХХ съезде Физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации», посвящённом памяти профессора А.А. Филаретова (Санкт-Петербург, 2007), International School of Neuroendocrinology (Seillac, France, 2007), а также на заседаниях Лаборатории нейроэндокринологии и Отдела физиологии и патологии высшей нервной деятельности Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (2004-2008).

Публикации по теме диссертации. Основное содержание диссертации отражено в 25 публикациях (из них 8 научных статей в рецензируемых российских и зарубежных журналах и 17 тезисов).

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 383 источника. Работа изложена на 164 страницах и иллюстрирована 42 рисунками и 13 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на самцах крыс линий Вистар (n=212); Koltushi High Avoidance (KHA, n=24) и Koltushi Low Aviodance (KLA, n=24), которые были селектированы на основе крыс Крушинского-Молодкиной в лаборатории генетики высшей нервной деятельности Института физиологии им. И.П. Павлова РАН по высокой (KHA) и низкой (KLA) скорости выработки условного рефлекса активного избегания в двусторонней челночной камере. В результате селекции животных по одному признаку были выявлены различия линейных животных также по другим поведенческим признакам, что позволяет говорить о противоположных стратегиях приспособительного поведения, демонстрируемых крысами линий KHA и KLA (Рыбникова и др., 1999).

Экспериментальные модели постстрессовых депрессивноподобных состояний у крыс. В качестве экспериментальной модели эндогенной депрессии использовалась парадигма «выученная беспомощность». Для выработки «выученной беспомощности» крыс подвергали неизбегаемому электрокожному раздражению в клетках размером 13х16х26 см с токопроводящим полом с переменными временными интервалами раздражения и отдыха так, чтобы каждая крыса в течение часа получила по 60 ударов током (1мА, 50 Гц) каждый длительностью 15 с (Seligman and Maier, 1967; Henkel et al., 2002). Исследования развития депрессивноподобного состояния во всех экспериментах проводились на 1-й, 5-й и 10-й дни после стресса.

Для индукции экспериментального аналога реактивного тревожно-депрессивного состояния (ПТСР) использовали модель «стресс-рестресс» (Liberzon et al., 1997). Крыс подвергали тяжелому комбинированному стрессу, состоящему из двухчасовой иммобилизации, 20-минутного вынужденного плавания и после 15-минутного перерыва – эфирного стресса до потери сознания. Триггером для развития тревожно-депрессивного патологического состояния являлся рестресс, заключавшийся в экспозиции животных 30-минутному иммобилизационному стрессу через 7 дней после первого комбинированного стресса. Исследования развития тревожно-депрессивного состояния во всех экспериментах проводились на 1-й, 5-й и 10-й дни после рестресса.

Методы изучения функции ГАС. Дексаметазоновый тест применялся для оценки торможения активности ГАС по механизму отрицательной обратной связи. В этом стандартном тесте, широко используемом в клинике, применяют введение синтетического аналога глюкокортикоидных гормонов – дексаметазона (Carrol, 1982). Дексаметазон вводился животным внутрибрюшинно в дозе 5 мкг/кг. В качестве оценочного показателя функционирования механизмов обратной связи использовали изменения уровня кортикостерона в плазме крови в ответ на введение дексаметазона. Тест проводили в течение двух дней: на третьи и четвёртые сутки после экспозиции животных неизбегаемому стрессу в парадигме «выученная беспомощность».

Состояние конечного звена ГАС у крыс в разные сроки развития патологий оценивали путем определения содержания основного глюкокортикоидного гормона крыс кортикостерона в плазме крови. Содержание кортикостерона в плазме крови определялось с помощью радиоиммунологического метода (Морозов и др., 1988).

Методы изучения поведения. Мониторинг поведения животных в ходе развития тревожно-депрессивных состояний в рассматриваемых моделях производили в тестах «открытое поле» (Holl, 1936; Маркель, 1988) и приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) (Pellow et al., 1985).

Тесты с применением антидепрессантов. Эффективная коррекция введением селективных антидепрессантов, применяемых для лечения соответствующих патологий в клинике, служила доказательством соответствия индуцированных в нашей работе тревожно-депрессивных расстройств экспериментальным формам эндогенной депрессии и ПТСР. Для коррекции постстрессовой депрессии в парадигме «выученная беспомощность» использовали раствор мапротилина метансульфоната (людиомил, Novartis Pharma, USA), который вводили каждому животному в дозе 15 мкг/кг внутрибрюшинно. Инъекции производились каждый день в течение 3 дней после экспозиции животных неизбегаемому стрессу. Эффект антидепрессанта на поведение и уровень кортикостерона оценивался соответственно на 5- и 10-й день после стрессорного воздействия.

В экспериментах по терапевтической коррекции экспериментального ПТСР был использован современный антидепрессант-анксиолитик паксил (пароксетина гидрохлорид, GlaxoSmithKline, UK). Паксил в виде суспензии на физиологическом растворе вводили каждому животному в дозе 20 мг/кг перорально, трехкратно – на 4-й, 5-й, 6-й день после травматического стресса. Корректирующий эффект паксила на поведение наблюдали в открытом поле на 1-е сутки после повторного стресса (рестресса), в тесте ПКЛ – на 5-е сутки после рестресса.

Иммуноцитохимический метод. Содержание CRH и вазопрессина в гипоталамусе и экстрагипоталамических структурах мозга, осуществляющих регуляцию ГАС, определялось с помощью иммуноцитохимического метода с использованием соответствующих антител. Для этого мозг животного быстро извлекался из черепной коробки, и выделенные гипоталамическая и экстрагипоталамическая области мозга помещалась в фиксатор – 4-% раствор параформальдегида в 0,4 М фосфатном буфере. Фиксация проводилась при температуре 0-4оС в течение 36-48 часов. Далее проводилась стандартная гистологическая обработка ткани, которая заключалась в проводке материала. Затем материал заливался в парафиновые блоки. Изготавливались чередующиеся срезы структур мозга во фронтальной плоскости толщиной 5-6 нм: 3,3 – 3,8 мм от брегмы для области мозга гиппокамп+фронтопариетальный неокортекс, 1,8 мм от брегмы – для гипоталамической области мозга (Paxinos and Watson, 1997). С помощью метода немеченых антител (авидин-биотинового) и иммунопероксидазной реакции проводили выявление CRH- и вазопрессин-иммунореактивного вещества (антигенов). Использовались первичные поликлональные антитела кролика к CRH (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA; 1:100) и вазопрессину (Abcam, UK; 1:500). Иммуногистохимическая реакция (двухэтапный метод с демаскировкой антигена) проводилась по стандартной схеме (Хериет и Гаттер, 1999). Для визуализации иммунной реакции использовали диаминобензидин. Уровень экспрессии CRH и вазопрессина оценивали в паравентрикулярном ядре гипоталамуса, CRH – также в аммоновом роге гиппокампа (полях СА1, СА3-4) и зубчатой извилине, во фронтопариетальной коре количественно на основании измерения оптической плотности окрашенного вещества в клетках [Smolen, 1990; Эллиниди и др., 2002] с помощью компьютерного цифрового анализатора изображения, включающего световой микроскоп Jenaval (Carl Zeiss, Germany), цифровую камеру Baumer CX05c (Baumer Optronic, Germany), компьютер и программное обеспечение Video Test Master Morphology (разработка ООО “Видео Тест”, Санкт-Петербург). Анализировали общее число иммунореактивных клеток и суммарное число средне- и интенсивно окрашенных клеток.

Для статистической обработки данных применялся однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA, пакет анализа STATISTICA 6.0). Различия между выборками считали значимыми при р?0,05. Результаты представлены в виде среднего арифметического ( ошибка среднего (SEM), а также в процентах от значений в контрольных группах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика депрессивноподобного состояния, развивающегося у крыс Вистар в модели «выученная беспомощность». У животных в парадигме «выученная беспомощность» развивалось устойчивое депрессивноподобное состояние, характеризующееся двигательной ретардацией (рис. 1, А-Б) и повышенной тревожностью (рис. 1, В). В данной модели также воспроизводились эндокринные нарушения, специфичные для эндогенной депрессии. В частности, у животных после экспозиции неизбегаемому стрессу наблюдался повышенный уровень кортикостерона (115,2±7,79 нмоль/л в контрольной группе vs. 247,5±35,99 нмоль/л в опытной группе; F1,14=5,93, р=0,04) и нарушение торможения ГАС по механизму отрицательной обратной связи, о чём свидетельствуют результаты дексаметазонового теста (табл. 1). Антидепрессант людиомил оказывал существенный тимоаналептический эффект. Это проявлялось в значимом увеличении двигательной активности (F1,10=9,75; р=0,018), снижении времени неподвижности в открытом поле (F1,10=5,26; р=0,05) животных, которым инъецировался антидепрессант, по сравнению с депрессивными животными, не получавшими инъекции людиомила. Также была отмечена нормализация уровня кортикостерона у животных в группе, получавшей антидепрессант (F1,10=7,18; р=0,03).

Динамика экспрессии кортиколиберина в структурах мозга, участвующих в регуляции ГАС, при развитии депрессивноподобного состояния в модели «выученная беспомощность». Обнаружено устойчивое повышение экспрессии CRH в гипоталамусе крыс в ходе развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность». В мелкоклеточной части паравентрикулярного ядра гипоталамуса (ПВЯ) было выявлено существенное увеличение общего количества CRH-иммунореактивных клеток (рис. 2) и числа средне- и интенсивно- экспрессирующих клеток на всех исследованных сроках формирования депрессивноподобного состояния (с 1-го по 10-й день после экспозиции животных неизбегаемому стрессу). В частности, наблюдалось увеличение общего количества CRH-иммунореактивных клеток на 113% (F1,12=28,5; р<0,001), и числа средне- и интенсивно- окрашенных клеток – на 243% (F1,12=63,28; р<0,001) относительно контроля на 10-й постстрессорный день.

Выявлено увеличение экспрессии CRH во всех исследованных полях гиппокампа к 10-му дню развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность» (рис.3). В поле СА1 отмечено значимое увеличение общего количества CRH-иммунореактивных клеток на 10-й постстрессорный день на 42,3% относительно контрольного уровня (F1,12=10,76; р=0,008), в поле СА3-4 – на 34,3% (F1,12=6,95; р=0,02), в зубчатой извилине – на 62,2% относительно контроля (F1,12=8,13; р=0,01). В неокортексе не выявлено значимых изменений экспрессии нейрогормона на 10-й день после стресса, когда депрессивноподобное состояние уже сформировалось.

Изменения экспрессии вазопрессина в гипоталамусе крыс Вистар при развитии депрессивноподобного состояния в модели «выученная беспомощность». Устойчивых изменений содержания иммунореактивного вазопрессина в CRH-ергических нейросекреторных ядрах гипоталамуса не выявлено. Однако наблюдалось транзиторное снижение экспрессии нейрогормона в ПВЯ гипоталамуса на 1-е сутки после экспозиции животных неизбегаемому стрессу (F1,12=45,31; р<0,0001) с последующей нормализацией этого показателя (рис. 4).

Таким образом, в наших исследованиях была установлена гиперактивация гипоталамического и некоторых структур экстрагипоталамического контура CRH-системы в экспериментальной модели эндогенной депрессии. Можно предположить, что именно активация гипоталамического звена системы, причем преимущественно его мелкоклеточной части, где CRH функционирует как активатор ГАС, лежит в основе наблюдаемых изменений функции ГАС, в частности, повышения уровня кортикостерона и нарушения регуляции ГАС по механизму отрицательной обратной связи. Вазопрессин, вероятнее всего, не вовлечён в формирование поведенческой депрессии и характерных нарушений функции ГАС у крыс в рассмотренный период развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность».

Рис. 1. Поведение крыс Вистар в открытом поле и ПКЛ после неизбегаемого стресса в парадигме «выученная беспомощность». А – горизонтальная двигательная активность в открытом поле; Б – время неподвижности (замираний) в открытом поле; В – индекс тревожности контрольных (светлые столбики) и подопытных (тёмные столбики) животных: 1/время пребывания в открытых рукавах ПКЛ.

* - значимые отличия от контроля, р <0,05.

Табл. 1. Базальный и стрессорный уровни кортикостерона в плазме крови (в нмоль/л) контрольных и подопытных животных после введения физиологического раствора и после введения дексаметазона. Время отсчитывается от начала первого забора крови (0`- базальный уровень гормона, 30`- через 30 мин после первого забора, т.е. стрессорный уровень гормона).

время, мин. 0' 0'-

дексаметазон % ? (0') 30' 30'- дексаметазон % ? (30')

контроль 203,0±43,34 52,0±10,12 74,37 787,9±144,99 161,3±48,06 79,5

опыт 385,3±41,28 265,0±47,45 31,2 * 743,1±49,91 586,2±31,44 21,1*

% ?, величина подавления, обозначенная в процентах от исходного уровня кортикостерона;

* - значимые отличия от контроля, р <0,05.

Рис.2. Динамика экспрессии кортиколиберина (общее количество иммунореактивных клеток, выраженное в процентах относительно контроля) в мелкоклеточной (светлые столбики) и крупноклеточной (тёмные столбики) частях паравентрикулярного ядра гипоталамуса крыс Вистар на разных сроках развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность». Пунктирной линией обозначен уровень экспрессии контрольной группы, принятый за 100%.

Рис. 3. Динамика экспрессии кортиколиберина (общее количество иммунореактивных клеток, выраженное в процентах относительно контроля) в полях гиппокампа крыс Вистар на разных сроках развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность». Пунктирной линией обозначен уровень экспрессии контрольной группы, принятый за 100%.

* - значимые отличия от контроля, р <0,05.

Рис.4. Динамика экспрессии вазопрессина (общее количество иммунореактивных клеток, выраженное в процентах относительно контроля – пунктирная линия), в мелкоклеточной (светлые столбики) и крупноклеточной (тёмные столбики) частях паравентрикулярного ядра гипоталамуса крыс Вистар на разных сроках развития депрессивноподобного состояния в парадигме «выученная беспомощность».

* - значимые отличия от контроля,

Развитие реактивного тревожно-депрессивного состояния у крыс Вистар в модели «стресс-рестресс». В наших экспериментах было показано, что животные, подвергнутые повторному стрессу в парадигме «стресс-рестресс», проявляют резко повышенную тревожность (табл. 2, рис. 5). У животных также обнаруживался сниженный уровень кортикостероидов (60% от контрольного уровня на 10-й день после рестресса; F1,18=7,43; р=0,01) – характерное для ПТСР эндокринное нарушение. При этом антидепрессант с выраженными анксиолитическими свойствами паксил, успешно применяемый в клинике для лечения ПТСР и являющийся препаратом первого выбора (Stein et al., 2000), оказывал антидепрессивный и анксиолитический эффекты в данной модели. Это проявлялось в нормализации общей горизонтальной двигательной активности в открытом поле на 1-е сутки после рестресса (F1,10=4,185; p=0,068) и существенном снижении времени неподвижности в сравнении с опытной группой животных, не получавших паксил (F1,10=10,71; p=0,039). Препарат также оказывал анксиолитический эффект в тесте ПКЛ на 5-е сутки после рестресса, что проявлялось в нормализации времени пребывания в центре (F1,10=1,96; p=0,51) и открытых рукавах лабиринта (F1,10=0,053; p=0,82) животных, получавших препарат.