DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 23.01.2012

Материалы

загрузка...

Морфогенез и его регуляция в культуре эпидермальных клеток человека

Воротеляк Екатерина Андреевна, 23.01.2012

 

ВОРОТЕЛЯК Екатерина Андреевна

МОРФОГЕНЕЗ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ В КУЛЬТУРЕ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Специальность – 03.03.04. клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Терских Василий Васильевич

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Ярыгин Константин Никитич (НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН)

Доктор биологических наук, Григорян Элеонора Норайровна (Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН)

Доктор биологических наук, Лагарькова Мария Андреевна (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН)

Ведущая организация: МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра клеточной биологии и гистологии

Защита состоится 21 марта 2012 г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д002.238.01 Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26;

e-mail: HYPERLINK "mailto:idbras@bk.ru" idbras@bk.ru ;

Факс: 8-499-135-80-12;

HYPERLINK "http://idbras.comcor.ru" http://idbras.comcor.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и на сайте Института HYPERLINK "http://idbras.comcor.ru" http://idbras.comcor.ru

Автореферат разослан февраля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова

ele0806@yandex.ru

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние несколько десятилетий клеточная биология и биология развития значительно продвинулись в понимании закономерностей регенерации и морфогенеза у многоклеточных организмов. Одним из инструментов, позволивших сделать это, явилось развитие техники культивирования клеток и тканей. При этом выяснилось, что с одной стороны эти подходы могут быть с успехом применены в фундаментальных исследованиях, а с другой – открывают совершенно новые перспективы для регенеративной медицины.

Эпидермис был одной из первых тканей, которую начали культивировать in vitro (Green, 2008). Способность эпидермальных клеток к реконструкции многослойного пласта с последующим встраиванием в нормальные ткани после пересадки позволила успешно применять культивированные кератиноциты для закрытия ожоговых дефектов кожи и ран (Терских В.В., Васильев А.В., 1995). Одновременно был открыт путь к изучению особенностей биологии эпидермальных клеток. При этом наибольшее число исследований касалось пролиферативной активности эпидермальных клеток и ее стимуляции, а также закономерностей дифференцировки. Связано это, прежде всего, с большим количеством травм и заболеваний кожи у человека, сопровождающихся гиперпролиферацией и нарушением программы дифференциации. Поиск стимулирующих пролиферацию агентов также позволил повысить эффективность культивирования эпидермальных клеток. С ростом интереса к проблеме стволовых клеток появилась серия исследований, посвященных структурно-функциональной организации эпидермиса и регенеративному потенциалу различных клеточных компартментов, его составляющих (Blanpain & Fuchs, 2006). Однако подавляющее большинство подобных работ было проведено с использованием лабораторных животных, часто генетически модифицированных. При кажущейся гистологической однородности эпидермиса оказалось, что его функционирование поддерживается сложной иерархической системой клеточных популяций. До сих пор динамическую структуру этой ткани нельзя считать окончательно выясненной. Еще меньше ясности имеется относительно развития этой системы в онтогенезе и ее восстановлении в ходе регенерации. При этом закономерности регенерации и морфогенеза эпидермиса у человека исследуются недостаточно. Между тем, на наш взгляд, подходы с использованием культуры клеток, могут многое прояснить в этой области. Восстановление многослойной структуры эпидермального пласта в культуре с возможностью его длительного культивирования указывает на прохождение процессов регенерации, которые представляют собой вторичное развитие. Возможность воспроизведения в культуре начальных этапов регенерации наиболее сложно устроенных структур – придатков кожи человека – позволит детально изучить механизмы их развития, а также патогенез многих заболеваний кожи и волос.

В то же время, накоплена значительная информация относительно развития и функционирования придатков кожи, в частности волосяных фолликулов у животных (Tiede et al., 2007; Fuchs, 2009). У мыши исследование данного объекта оказалось чрезвычайно плодотворным для определения механизмов эпителио-мезенхимного взаимодействия в ходе морфогенеза и регенерации (Botchkarev et al., 1999; Rendl et al., 2005). Выяснилось также, что волосяной фолликул содержит несколько популяций стволовых клеток, имеющих разное происхождение. Потенциал этих клеток кажется сегодня настолько широким, что кожу можно рассматривать в качестве весьма перспективного источника клеточного материала для регенеративной медицины. Однако закономерности эпителио-мезенхимных взаимодействий, регенерации и морфогенеза, а также структуру и потенциал клеточных популяций волосяного фолликула у человека невозможно в достаточной мере изучить только с помощью методов, используемых на лабораторных животных. Это привело к возникновению пробела в изучении структурно-функциональной организации эпидермиса, эпителио-мезенхимных взаимодействий в ходе морфогенеза и регенерации у человека. Поэтому возникла необходимость разработки новых подходов. Настоящая работа посвящена изучению этих вопросов.

Цель исследования. Изучение морфогенетических процессов и механизмов их регуляции в культуре эпидермальных кератиноцитов человека.

Задачи:

Исследовать закономерности формирования эпидермального пласта из кератиноцитов человека и возможность реконструкции структурно-функциональных единиц in vitro.

Определить способ и механизмы миграции многоклеточных кластеров на пластике и коллагеновом геле in vitro.

Охарактеризовать динамику пролиферативной активности мигрирующих клеток.

Определить сохраняются ли стволовые/прогениторные эпидермальные кератиноциты в культуре, и каковы их характеристики.

Создать клеточную модель, позволяющую изучать эпителио-мезенхимные взаимодействия и эпидермальный морфогенез in vitro, использовать ее для моделирования фолликулогенеза и изучения его механизмов.

Разработать методы для выделения и культивирования клеток дермальной папиллы (волосяного сосочка) и охарактеризовать фенотип, дифференцировку и морфогенетический потенциал этих клеток.

Оценить динамику транскрипции генов ключевых сигнальных путей в клетках дермальной папиллы при культивировании.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые показано, что культивированные эпидермальные клетки человека сохраняют способность к морфогенезу вне организма, в частности, в ходе эпителио-мезенхимных взаимодействий. Обоснована возможность реконструкции в культуре структурно-функциональных единиц кожи человека.

Найден новый клеточный механизм коллективной миграции кластера эпидермальных кератиноцитов человека. Впервые изучены ультраструктурные особенности таких кластеров. Продемонстрирована активация эпидермальных клеток при культивировании и способность к миграции клеток высокого уровня дифференцировки. Обнаружен феномен базальной миграции эпидермальных клеток в отсутствие сыворотки и митогенов.

Установлены закономерности эпителизации коллагенового геля эпидермальными кератиноцитами человека при взаимодействии с различными компонентами матрикса и мезенхимными клетками, включенными в состав геля. Впервые на основании этих данных разработана модель, воспроизводящая ключевые события морфогенеза волосяного фолликула человека в культуре. Продемонстрировано, что клетки дермальной папиллы человека полипотентны, индуцируют эпидермальный морфогенез и ангиогенез.