DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 21.09.2012

Материалы

загрузка...

Разработка технологии концентрирования глубинной культуры вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз

Пиков Александр Васильевич, 21.09.2012

 

Практическая значимость работы.

Разработана технология концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Br. melitensis Rev-1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз.

Из полученных микробных концентратов приготовлены партии вакцины живой сухой, проведены исследования на соответствие препаратов требованиям НД. Показано соответствие готовых вакцинных препаратов основным требованиям НД.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Возможность концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1, с использованием установки «Сартокон – 2».

2. Параметры подготовки и стерилизации оборудования.

3. Параметры процесса концентрирования, обеспечивающие получение микробных концентратов бруцелл в промышленных условиях и воспроизведение технологического процесса концентрирования.

4. Возможность получения готового препарата вакцины против бруцеллеза овец и коз, отвечающего требованиям НД, на основе микробных концентратов, полученных мембранным способом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Наука. Производство. Экология» (г.Киров, 2010).

Публикации научных исследований. По результатам диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 109 страницах компьютерного текста. Диссертационная работа включает: введение, аналитический обзор, выбор направления исследований, теоретические и экспериментальные исследования, обобщение результатов исследований, выводы и заключение. Список использованной литературы включает 123 источника, из них 100 отечественных, 17 – иностранных и 6 – материалы из сети Интернет. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками, содержит 2 приложения.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Животные. Для оценки безвредности микробных концентратов использовали аутбредных белых мышей обоего пола, 35 – 40 дневного возраста, весом 35 – 40 г.

Питательные среды и растворы. В работе использовали 50%-й раствор глюкозы с витаминами, МПБ, МПА, бруцеллагар, сахарозо-желатиновую защитную среду, физраствор. Для глубинного культивирования бруцелл использовали культуральную среду на основе ферментативного гидролизата мяса,

Штаммы микрорганизмов. Использовали вакцинные штаммы Br. melitensis Rev–1 и Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ, полученные из ФГБУ ВГНКИ Ветеринарных препаратов.

Основное оборудование. Глубинные культуры бруцелл выращивали в бутылях объемом 20 дм3 и в биореакторах БИОР-0,25 м3 (ОКБ ТБМ, г. Кириши Ленинградской обл.), оснащенных перемешивающим устройством магнитного типа.

Для концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Br. melitensis Rev–1 использовали установки микрофильтрации "Сартокон-мини" и "Сартокон-2" (производства предприятия "Владисарт", г.Владимир, Россия), мембранные модули "Ультрасарт" на основе полисульфона с порогом задержания 300 кДа, мембранные модули «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с размером пор 0,2 мкм, мембранные модули на основе полипропилена с размером пор 0,2 мкм, мембранные модули на основе полипропилена с размером пор 0,45 мкм (производства предприятия "Владисарт", г.Владимир).

Замораживание препарата для лиофилизации осуществлялась в низкотемпературной морозильной камере производства фирмы «Frigera» (Чехословакия). Лиофилизация препарата осуществлялась в сублимационной установке LZ – 45.27 производства фирмы «Frigera» (Чехословакия).

Методы оценки качества препаратов. Для изучения свойств микробных суспензий и приготовленной на их основе вакцины применяли методы оценки качества по следующим показателям:

- содержание живых микроорганизмов в 1 см3 микробной суспензии (биологическая концентрация, БК)определяли методом высева на плотную питательную среду;

- оптическая концентрация (ОК) бруцелл в 1 см3 микробной суспензии по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича;

- наличие и степень диссоциации бруцелл определялась в пробах с акрифлавином и по Уайт – Вилсону;

- реакцию среды рН определяли потенциометрическим методом;

- безвредность препаратов определялась введением белым мышам препаратов бруцелл подкожно в соответствии с рекомендациями Стандарта организации «Вакцина против бруцеллеза овец и коз и инфекционного эпидидимита баранов из штамма B.melitensis Rev – 1 живая сухая» СТО 00494189-0001-2004.

- остаточная влажность готовой формы препарата определяли гравиметрическим методом;

- наличие посторонней микрофлоры определяли микроскопией окрашенных по Граму мазков и методом выращивания на плотной питательной среде;

- определение остаточной концентрации формалина в промывных водах установки «Сартокон-2» проводили сульфитным методом.

Обработка результатов. Результаты экспериментальных исследований представлены в виде среднего арифметического значения с определением доверительного интервала при уровне вероятности, равном 95%. Достоверность различий определялась согласно рекомендациям ГОСТа 15895-77 и в соответствии с рекомендациями И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева.

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Изучение возможности применения мембранной техники для концентрирования нативных культур Brucella melitensis Rev – 1

Концентрирование осуществлялось на лабораторной установке «Сартокон-мини» путем циркуляции нативной культуры с отводом фильтрата в промежуточную емкость (стерильная стеклянная бутыль вместимостью 20,0 дм3). Концентраты получены из экспериментально приготовленных глубинных культур, выращенных в бутылях объемом 20 дм3. Концентрация бруцелл в бутылях составляла 15 - 20 млрд.м.к.*см-3, объем нативной культуры в бутыле 15 – 17 дм3 (1 бутыль – 1 концентрат).

В экспериментах использовались следующие типы мембранных модулей:

мембрана «Ультрасарт» на основе полисульфона с порогом задержания 300 кДа;

мембрана «Микросарт» на основе полипропилена с размером пор 0,2 мкм;

мембрана «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с размером пор 0,2 мкм;

мембрана «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с размером пор 0,45 мкм.

Использование мембраны с диаметром пор 0,45 мкм показало свою нецелесообразность ввиду уноса бруцелл с фугатом, что приводит не только к потерям целевого продукта, но и к быстрому забиванию мембраны дисперсной фазой и невозможности длительного использования ее в производстве.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1. Среднее время концентрирования представлено, как среднее арифметическое времени концентрирования бутыли после отмывки мембран рекомендуемыми средствами. G – производительность мембраны по дистиллированной воде от номинала после 5 циклов концентрирования с отмывкой мембраны рекомендуемыми средствами после каждого цикла концентрирования.

Таблица 1