DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 21.04.2011

Материалы

загрузка...

Бактериофиксирущая активность эритроцитов в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза и обоснование её роли в патогенезе данных заболеваний

Оборин Виктор Афанасьевич, 21.04.2011

 

Как известно, взаимодействие про- и эукариотических клеток представляет собой сложные физико-химический и биологический процессы. На первой стадии адгезивного процесса происходят приближение бактерий (до 100 нм) и удержание их на поверхности клеток хозяина. По мнению В.В. Федорович, С.В. Калюжный, Ван дер Мирен (2002) и Н.Ф. Дмитриевой, Ю.М. Тимофеевой, Н.И. Брико (2007), основную роль в этом процессе играют гидрофобно-гидрофильные свойства поверхностей.

Для подтверждения данного положения были проведены сравнительные исследования адгезивной активности и гидрофобных свойств культур Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на ГРМ-агаре при различных температурных режимах (рис. 13). Микробные клетки, культивируемые при температурах 20±1 ?С и 28±1 ?С и обладающие выраженными адгезивными свойствами, проявляли достаточно высокую гидрофобность (значения ПГ составляли 38–44%). У культуры, выращенной при температуре 37±1 ?С и характеризующейся низкой адгезивностью, гидрофобные свойства были выражены относительно слабо – ПГ находился на уровне 8%.

Рис. 13. ПБФАЭ и ПГ культур Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при различных температурных режимах

Последующие эксперименты показали, что БФАЭ человека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ и гидрофобность микробной культуры этого штамма зависят не только от температуры культивирования, но и от состава питательной среды (табл. 8). При выращивании бактерий на АХ их адгезивные и гидрофобные свойства были значительно выше, чем при выращивании на МПА. При этом добавление в состав МПА сульфата натрия и генцианвиолета не оказывало значительного влияния на адгезивность и гидрофобность микробных клеток; в то же время внесение этих ингредиентов в АХ приводило к значительному повышению уровня адгезии и в меньшей степени - гидрофобности испытуемой культуры. Между значениями ПБФАЭ и ПГ микробных культур выявили высокую степень корреляционной связи (r=0,9), что позволило высказать предположение о важной роли гидрофобных сил в процессе фиксации эритроцитами человека клеток Y. pestis EV НИИЭГ.

Таблица 8

ПБФАЭ человека в отношении бактерий Y. pestis EVНИИЭГ и ПГ микробных культур, выращенных при 28±1 ?С на питательных средах различного состава (М±m, n=5)

Дополнительные ингредиенты

в питательной среде Питательная среда

МПА АХ

ПБФАЭ, % ПГ, % ПБФАЭ, % ПГ, %

Отсутствуют 35,93±3,87 15,26±3,34 59,67±3,81 27,44±3,32

Сульфит натрия 29,24±4,75 13,52±3,02 74,48±2,71 30,48±3,48

Генцианвиолет 34,26±4,48 16,95±3,75 78,21±3,21 29,15±3,57

Сульфит натрия и генцианвиолет 38,97±9,19 15,72±3,96 76,63±2,97 32,26±0,77

В то же время при изучении электрофоретической подвижности микробных культур Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при разных температурах и на различных по составу питательных средах, существенных различий не выявлено. Следовательно, в сближении эритроцитов с клетками Y. рestis EV НИИЭГ основную роль играют гидрофобные взаимодействия.

После приближения бактерий к клеткам-мишеням на расстояние менее 100 нм начинают проявлять действие ван-дер-ваальсовы и водородные силы, которые обеспечивают лиганд-рецепторное взаимодействие бактерий с клеткой хозяина (Езепчук Ю.В., 1985; Дмитриева Н.Ф., Тимофеев Ю.М., Брико Н.И., 2007). При этом происходит узнавание адгезинами бактерий рецепторов эукариотических клеток. Первоначально нами были проведены исследования по изучению влияния на процесс фиксации к эритроцитам адгезинов микробных клеток Y. pestis EV НИИЭГ. Для этого оценивали адгезивную способность микробных культур, выращенных на различных по составу питательных средах. Эксперименты показали, что микробные клетки, культивируемые на АХ и ГРМ-агаре, обладают более выраженной способностью фиксироваться на эритроцитах, чем бактерии, выращенные на МПА. Кроме того, было установлено, что дополнительные ингредиенты (сульфит натрия и генцианвиолет) повышают адгезивные свойства культур при добавлении их в АХ и ГРМ-агар (табл. 9).

Таблица 9

ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на различных питательных средах (М±m; n=5)

Дополнительные ингредиенты ПБФАЭ, %

МПА ГРМ-агар АХ

Отсутствуют 35,93±3,87 55,73±2,62 59,67±3,81

Сульфит натрия 29,24±4,75 71,42±2,85* 74,48±2,71*

Генцианвиолет 34,26±4,48 78,91±2,17** 78,21±3,21*

Сульфит натрия и генцианвиолет 38,97±9,19 73,88±2,31** 76,63±2,97*

Примечание: * P<0,05; ** P<0,01 – по сравнению с уровнем БФАЭ в отношении бактерий, выращенных на питательной среде без дополнительных ингредиентов.

Далее изучили ПБФАЭ в отношении 24-, 48- и 72-часовых микробных культур, выращенных при температурах 20±1, 28±1 и 37±1 °С на ГРМ-агаре с генцианвиолетом (рис. 14).

Рис. 14. ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ в зависимости от температуры выращивания и возраста микробной культуры

Как показали исследования, в наибольшей степени эритроциты человека фиксировали клетки Y. pestis EV НИИЭГ, выращенные при температуре (28±1) °С. При этом у 24- и 48-часовых культур величина ПБФАЭ имела наибольшие значения 78–81%. В то же время у 72-часовых культур, выращенных при данной температуре, отмечали достоверное (Р<0,05) снижение ПБФАЭ по сравнению с 24- и 48-часовой культурами. ПБФАЭ в отношении микробных клеток, культивируемых при температуре 20±1 °С, находился на уровне 60%. При этом значения БФАЭ в отношении культур с различными сроками выращивания статистически значимо друг от друга не отличались. Бактерии, выращенные при температуре 37±1 °С, фиксировались на эритроцитах в значительно меньшей степени. Значения ПБФАЭ для них находились в пределах 10 – 20% и достоверно не отличались у 24-, 48- и 72-часовых культур.

Согласно данным Г.Я. Ценевой, Н.Ю. Солодовниковай, Е.А. Воскресенской (2002), охарактеризованный ранее адгезин Y. pestis (белок рН6 антиген) экспрессируется только в диапазоне температур 35…41 ?С в кислых условиях среды. Наши результаты, показывающие высокую адгезивную активность клеток Y. pestis EV НИИЭГ при относительно низких температурах, свидетельствовали о наличии у чумного микроба и других адгезинов, что совпадало с данными, полученными И.В. Бахтеевой (2008).

На следующей стадии исследований оценивали взаимодействие микробных культур, подвергнутых обработке трипсином и прогреванию при температуре 56±1?С. Результаты проведенных экспериментов отражены на рис. 15 и 16. Установили, что величина ПБФАЭ, после обработки микробных клеток трипсином в течение 1 – 3 часов, а также после прогревания суспензии бактерий в течение 10 – 30 минут, значительно снижалась.

Рис. 15. Зависимость ПБФАЭ человека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ от продолжительности обработки бактерий трипсином

Рис. 16. Зависимость ПБФАЭ человека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ от продолжительности прогревания микробной культуры при температуре 56±1 ?С

Проведенные исследования позволяют предположить, что структуры бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, отвечающие за прикрепление к эритроцитам человека, имеют белковую природу, однако при воздействии высокой температуры и ферментативной обработки бактерий их способность связываться с эритроцитами полностью не исчезала. Следовательно, в фиксации бактерий на эритроцитах, помимо поверхностных белков, участвуют и другие субстанции. Учитывая высокую корреляционную связь гидрофобности и адгезивности клеток Y. pestis EV НИИЭГ, можно предположить, что структуры, ответственные за связывание бактерий эритроцитами, являются липопротеидами.

Для оценки влияния экстрацеллюлярных метаболитов на способность бактерий фиксироваться на эритроцитах человека провели сравнительные исследования БФАЭ в отношении микробных культур, трижды отмытых 0,9%-ным раствором хлорида натрия, и культур, полученных, минуя стадию отмывания. Уровень БФАЭ в отношении микроорганизмов, выращенных на различных по составу средах после отмывания достоверно не отличался от контроля, следовательно, внеклеточные продукты метаболизма бактерий не влияли на их способность фиксироваться на эритроцитах человека.

Далее изучали БФАЭ в отношении культур Y. pestis EV НИИЭГ, которые пассировали через питательную среду и организм белых мышей (рис. 17, 18).

Рис. 17. ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ после различного количества пассажей бактерий через питательную среду

Рис. 18. ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ после различного количества пассажей бактерий через организм белых мышей

Данные рис. 17 и 18 свидетельствуют о том, что уровень БФАЭ в отношении бактерий достоверно не отличался от исходного после 12 пересевов через среду выращивания (ГРМ-агар с генцианвиолетом), а также после 5 пассажей через организм белых мышей. Следовательно, пассажи и пересевы бактерий Y. pestis EV НИИЭГ не оказывают влияния на состояние структур микробных клеток, которые ответственны за взаимодействие с рецепторами эритроцитов, но имеется тенденция к снижению ПБФАЭ в зависимости от количества пассажей и пересевов.

Таким образом, установлено, что уровень бактериофиксирующей активности эритроцитов зависит от адгезинов микробных клеток. Показано, что эритроциты человека обладают более выраженной фиксирующей способностью в отношении микробных клеток, выращенных при температуре 28±1 °С в течение 1 – 2 суток на АХ и ГРМ-агаре. Известно, что именно эти условия используются при приготовлении живой чумной вакцины (Коробкова Е.И., 1956; Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г., 1992; Наумов А.В., Самойлова Л.В., 1992). Вероятно, высокая фиксирующая активность эритроцитов в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных в оптимальных условиях, играет определенную роль в формировании специфического иммунитета при чуме.

Считается, что уровень адгезии бактерий к эритроцитам зависит не только от лигандов бактерий, но и от рецепторов эукариотических клеток (Езепчук Ю.В., 1985; Дмитриева Н.Ф. Тимофеев Ю.М., Брико Н.И., 2007), поэтому на следующем этапе исследований изучили влияние на БФАЭ в отношении Y. pestis EV НИИЭГ рецепторов эритроцитов людей, отвечающих за групповую принадлежность по системе АВ0 и Rh. Как показали результаты экспериментов, значения БФАЭ доноров 0(I), А(II), В(III), АВ(IV) в отношении штамма Y. рestis EV НИИЭГ статистически значимо друг от друга не отличались (рис. 19). Достоверных различий между ПБФАЭ при использовании эритроцитов резус-положительных (Rh+) и резус-отрицательных (Rh–) доноров также не было выявлено (рис. 20).