DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 21.03.2011

Материалы

загрузка...

Реакция организмов на действие природных атмосферных взвесей(экспериментальное исследование)

Голохваст Кирилл Сергеевич, 21.03.2011

 

Оценку антиоксидантной активности проводили по содержанию основных компонентов антиоксидантной системы (АОС) (витамин Е, церулоплазмин) и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (диеновых конъюгат, малонового альдегида (МДА) и гидроперекисей). В опыт брали 120 самцов беспородных крыс возрастом не старше 2,5 мес, массой 100-150 г. Перед началом биохимического исследования готовили гомогенаты легких, в которых определяли компоненты АОС и ПОЛ. Липиды крови и тканей экстрагировали по методу Блайя-Дайера (Кейтс, 1975). Определение церулоплазмина в плазме крови производили по методу, основанному на окислении р-фенилендиамина при участии церулоплазмина (Колб, Камышников, 1976). МДА определяли в плазме крови и гомогенатах легких по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Бородин, Арчаков, 1987). Определение диеновых конъюгатов проводили по методу Е.А. Стальной (1977). Количество гидроперекисей липидов определяли на основе их способности окислять ионы Fe2+ с последующим взаимодействием Fe3+ с тиоцианатом аммония (Романова, Стальная, 1977). Содержание витамина Е определяли в липидных экстрактах плазмы крови и тканей по цветной реакции с дипиридилом и FeCl3 (Кисилевич, 1972) в модификации М.А. Штарберга (1996).

Определение ПОЛ в суспензии микросом при добавлении частиц минералов проводили по методике Е.А. Бородина с соавт. (1992) .

Для проверки рабочей гипотезы, согласно которой антиоксидантная активность минералов зависит от их способности сорбировать ионы Fe2+, к 1 мл 1,28 мМ Fe2+ добавляли от 10 до 100 мг минерала. В качестве источника Fe2+ использовали соль Мора (FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O). Далее смесь центрифугировали, отбирали 0,1 мл надосадочной жидкости и определяли в ней содержание ионов Fe2+ по цветной реакции с К3[Fe(CN6)] (Голохваст и др., 2010).

Изучение токсичности частиц цеолитов при ингаляционном (1-10 мкм) и пероральном (0,1-1 мкм) введении

Для определения токсичности цеолитов при ингаляционном введении у тех же интактных животных (беспородных крыс), которые использовались при изучении антиоксидантной активности in vivo и влияния на систему местного иммунитета дыхательных путей, забирался материал для получения полутонких срезов препаратов печени, почек, легких. Срезы окрашивались гематоксилином-эозином и метиленовым синим.

Для определения токсичности цеолитов при пероральном введении использованы неинбредные мыши самцы (масса 18-20 г). Они получали цеолит с пищей в дозировке 3 – 5% от массы тела. Животных разделили на 16 экспериментальных групп по 8 особей в каждой, в том числе: "Контроль" - животные, которые не получали цеолит; "Куликов-м", "Куликов-у", "Куликов-н" - мыши, которые получали цеолиты Куликовского месторождения после механической, ультразвуковой и планетарной обработок. "Вангин-м", "Вангин-у", "Вангин-н" - получали цеолиты Вангинского месторождения с аналогичной обработкой; "Люльин-м", "Люльин-у", "Люльин-н" - получали цеолиты Люльинского месторождения; "Шивертуй-м", "Шивертуй-у", "Шивертуй-н" - цеолиты Шивертуйского месторождения; "Холин-м", "Холин-у", "Холин-н" - мыши, которые получали Холинские цеолиты.

Изучение механизмов иммуностимулирующего действия частиц цеолитов

(1-10 мкм)

Для исследования механизмов иммуностимулирующего действия минералов было изучено влияние цеолита Лютогского месторождения (далее «Цеолит») на продукцию цитокинов in vitro по стандартному методу Де Грута с соавт. (De Groote et al., 1992). При исследовании спонтанного синтеза цитокинов частицы минералов добавляли в кровь интактных доноров (n=8) в конечной концентрации 5 и 50 мг/мл. Для изучения митогениндуцированной продукции цитокинов во все пробы вносили фитогемагглютинин (ФГА) в конечной концентрации 10 мкг/мл. Продукцию IL-1? и IL-10 оценивали через 24 ч инкубации, продукцию IFN-? – через 72 ч. Костимулирующее влияние цеолита изучали при его совместном действии с ФГА. Клетки инкубировали при 37?С в атмосфере 5% СО2, после чего отбирали супернатанты и определяли концентрацию цитокинов, которую измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем «Протеиновый контур» (IFN-?, IL-10) и «Цитокин» (IL-1?).

Изучение влияния минералов на межклеточные взаимодействия

В качестве модели для этого исследования взята агрегация тромбоцитов. Наблюдения проводили на анализаторе агрегации тромбоцитов AP 2110 («Солар», Беларусь), совмещенного с компьютером, в спектральном диапазоне от 500 до 700 нм. В основе принципа работы агрегометра лежит метод светорассеяния (турбидиметрический метод), предложенный С. Борном (Born, 1962), с дополнениями И.Э. Памирского с соавторами (2010). Спектрофотометрически (при длине волны 259 нм) была измерена оптическая плотность растворов АДФ (концентрация АДФ составляла около 12,5 мкМ на 1 мл физиологического раствора), и затем этих же растворов после внесения суспензий минералов (0,1 мл 1% суспензии на 3 мл раствора АДФ, или около 200-250 мкг минеральных частиц на мл; смесь не инкубировали) и центрифугирования в течение 10 минут при 2000 g.

Оценка микробиологической активности частиц минералов

(0,1-1 мкм и 1-10 мкм)

Для определения микробиологической активности цеолитовых туфов Вангинского, Куликовского и Лютогского месторождений, а также кварца, полевого шпата и вулканического стекла были взяты культуры условно-патогенных бактерий E. coli 25922, St. aureus 209-P и 906, полученные из ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва). В работе использовали стандартные методики и культуральные среды: желточно-солевой агар (ЖСА), мясо-пептонный агар (МПА) и среда Эндо. Цеолитовые породы, кварц, полевой шпат и вулканическое стекло в двух размерных фракциях (0,1-1 мкм и 1-10 мкм) применялись как стерильные (обработка паровой стерилизацией при температуре 1200С в течение 1 ч), так и нестерильные. Для изучения длительности антимикробного воздействия после приготовления раствора (1 млрд. клеток) по стандарту мутности минералы инкубировали вместе с бактериями в течение 30 мин, 1 ч, 24 ч. Затем согласно стандартным методикам сеяли суспензию на МПА и среду Эндо и помещали в термостат на 24 ч при температуре 370С, после визуально подсчитывали число КОЕ.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Качественный и количественный анализ взвеси атмосферных осадков

К настоящему времени методики исследования природных взвесей позволяют определять химический (элементный) и гранулометрический составы, а также физико-химические свойства. Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки. Классификация взвешенных в атмосферном воздухе частиц только по размеру не учитывает состав и физико-химические характеристики компонентов. В свою очередь, только химический анализ взвесей может выявить наличие в них токсичных веществ, но не позволяет оценить размер и свойства частиц. Нами использован метод гранулометрического анализа атмосферных взвесей с последующим минералогическим анализом.

Пробы снега (N=5) собирались на шести станциях, различающихся экологическими условиями, расположенных как непосредственно в черте города, так и в его пригородной зоне (рис. 1). Среди них наиболее экологически напряженными являются станции, находящиеся в микрорайонах Первой и Второй речек (Христофорова, 2005).

Согласно принятой классификации (Ивлев, Довгалюк, 1999), различаются по размерам три класса аэрозольных частиц: мелкодисперсные (r ? 0,1 мкм), среднедисперсные (0,1 мкм < r < 1 мкм) и грубодисперсные ( r ? 1 мкм). Анализируя атмосферные взвеси города, мы разделили их по размерам частиц, согласно данным лазерного анализатора, на пять классов: 1) от 0,1 до 1 мкм (соответствует PM1), 2) от 1 до 10 (соответствует PM10), 3) от 10 до 50, 4) от 50 до 100 и 5) > 100 мкм.

Результаты разделения по фракциям и физико-техническим характеристикам частиц взвесей, обнаруженных в снеге, приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Распределение частиц в снеге по фракциям на станциях отбора проб

Районы отбора проб

Ул. Пушкинская Первая речка Вторая речка П-ов Шкота Садгород Пос. Емар

Класс и (, мкм (, мкм доля, % (, мкм доля, % (, мкм доля, % (, мкм доля, % (, мкм доля, % (, мкм доля, %

1. 0,1 - 1

0,15 – 0,3 10

2. 1 - 10 2-5 2 2-3 2-3

5-7 15 4 - 8 20 4-8 65 5-10 5 6-10 2

10-50 15-20 2 12 - 20 20-25

40-50 50 30-40 25 30-45 30 25-35 10

4. 50 - 100 40-50 2

40-70 55

5. > 100 200-450 94

300-500 95

400-1000 85 600-1000 3

Как можно видеть из табл. 1, частицы с диаметром менее 10 мкм в малых количествах встречаются на всех станциях отбора. Наибольшее же количество мелких частиц, взвешенных в атмосферном воздухе, выявлено на полуострове Шкота – 70%. На станциях отбора проб, расположенных в районах Первой и Второй речек, доля тонких частиц во взвеси оказалась близкой – 28% и 20% соответственно. Однако в районе Первой речки, единственном из шести обследованных мест, значительной была доля очень тонких частиц (< 1 мкм) – 10%.

В атмосферной взвеси пос. Емар заметно преобладали крупные частицы, с размером 300 – 500 мкм (95%). В Садгороде еще более крупные частицы (400 – 1000 мкм) составляли 85% взвеси. Таким образом, в этих двух районах с наименьшим техногенным прессом в составе атмосферной взвеси доминировали крупные частицы.

Однако на ул. Пушкинской, испытывающей воздействие грузового и легкового автотранспорта, в составе взвеси также преобладали крупные частицы (94%), правда, с немного меньшими размерами (200 – 450 мкм), чем в пос. Емар.

Наши результаты в целом соотносятся с данными литературы. Так, считается, что в атмосферных аэрозолях преобладают частицы размером менее 1 мкм (Глазовский, 2006). По данным Х.Е. Юнге (1965), доля частиц Айткена, то есть частиц размером менее 0,1 мкм, составляют не более 10-12%. По другим данным, доля частиц размером менее 5 мкм составляет 95%, но по массе - всего 7% (Глазовский, 2006).