DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 20.12.2010

Материалы

загрузка...

Системы клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков

Белжералская Светлана Николаевна, 20.12.2010

 

Трансдукция клеток млекопитающих Hek293Т и Huh7 модифицированным бакуловирусом AcMNPV, несущим последовательности кДНК структурных генов ВГС, приводит к экспрессии клонированных генов полипротеина ВГС и их правильному процессингу с образованием продуктов генов структурных белков вируса.

9.2. Исследование посттрансляционного гликозилирования оболочечных белков ВГС.

Важным этапом морфогенеза вирусных частиц, предопределяющим правильную сборку вириона ВГС, является гликозилирование структурных белков в зараженной клетке. Гликозилирование происходит в ЭР под действием олигосахаридтрансферазы, причем с белками взаимодействуют только олигосахариды с высоким содержанием маннозы. Наличие углеводных цепей в молекулах белков Е1 и Е2 ВГС определяет их третичную структуру, стабильность, антигенность и специфику взаимодействия с другими компонентами вириона.

В зрелом вирионе гликопротеины Е1 и Е2 ВГС высокогликозилированы и содержат 5–6 и 9–10 сайтов гликозилирования соответственно (рис.27).

Рис. 27. Схема распределения сайтов гликозилирования в молекулах белков Е1 и Е2 ВГС.

Известно, что наличие или отсутствие N-гликанов у оболочечных белков вируса может влиять на структуру белков, их стабильность, специфичность действия, белок-белковые взаимодействия. В литературе обсуждается влияние гликозилирования на образование гликопротеинового комплекса, на сворачивание заякоренных в мембране гликопротеинов ВГС, однако, в целом, процесс сборки вирусной частицы остается малопонятным. Следует отметить, что до сих пор не известно точное число сайтов гликозилирования белка Е1, какие именно сайты гликозилирования участвуют в модифицировании белка Е1 и все ли потенциальные сайты гликозилирования реализуются in vivo.

Для исследования эффективности гликозилирования гликопротеинов ВГС, влияния гликанов на экспрессию и процессинг Е1 и Е2, на образование продуктивного комплекса гликопротеинов и на формирование вирусоподобных частиц ВГС мы использовали бакуловирусную систему экспрессии в клетках насекомых и мутагенез N-связанных сайтов гликозилирования.

9.2.1. Получены генетические конструкции, кодирующие 11 вариантов белка Е1, несущих мутации в 7 сайтах гликозилирования и обеспечивающие экспрессию в клетках насекомых для исследования влияния индивидуальных углеводных цепей в составе белка Е1 на образование комплекса Е1Е2.

1- Е1(N1)Е2, с мутацией в сайте N1;

2- Е1(N5)Е2, с мутацией в сайте N5

3- Е1(N1,5)Е2, с мутациями в сайтах N1 и N5;

4- Е1(N2,3,4)Е2, с мутациями в сайтах N2, N3 и N4

5- Е1(N2,3,4,5)Е2, с мутациями в сайтах N2, N3, N4 и N5;

6- Е1(N1,2,3,5)Е2, с мутациями в сайтах N1,N2, N3 и N5;

7- Е1(N1-5)Е2, с мутациями во всех сайтах N1- N5;

8- Е1(N5)Е2, с мутацией в сайте N5;

9- Е1(N6)Е2, с мутацией в сайте N6;

10- Е1(N7)Е2, с мутацией в сайте N7;

11- Е1Е2 без мутаций (W)

В данной работе применяли олигонуклеотид-направленный мутагенез непосредственно на «стандартных» двутяжевых плазмидных векторах, схема которого разработана и предложена В.Л. Друцей (МГУ). В результате была сконструирована серия рекомбинантных плазмид pBluescriptKS-E1, несущих кДНК белка Е1 с точечными заменами в сайтах гликозилирования N1 – N5 и двумя дополнительными сайтами гликозилирования N6 и N7, для чего синтезированы синтетические олигонуклеотидные праймеры, содержащие последовательности, кодирующие сайты N-гликозилирования Asn-X-Thr/Ser (X ? Pro), в котором триплет, кодирующий Asn, замещен триплетом, кодирующим Gln. Таким образом, был создан набор Е1-гликозилированных мутантов, в которых выключены/включены или добавлены сайты гликозилирования для анализа N-гликозилирования оболочечного белка Е1 ВГС.

9.2.2. В плазмидном бакуловирусном векторе pFastBacHTа клонировали фрагменты ДНК, содержащие последовательность кДНК гена Е1 (E1mut) с мутациями в сайтах гликозилирования, а также кДНК, включающую последовательность генов E1mutE2.. Рекомбинантные конструкции использовали для получения бакмидных ДНК и трансфекции клеток насекомых для получения рекомбинантных бакуловирусов.

9.2.3. Экспрессию Е1-гликозилированных мутантов в клетках насекомых, а также эффективность гликозилирования белков Е1 с мутациями в потенциальных сайтах гликозилирования анализировали с помощью иммуноблотинга (Рис. 28).

Рис. 28. Вестерн-блот анализ продуктов экспрессии генов мутантных белков Е1 в комбинации с Е2 ВГС в клетках насекомых Sf9 с антителами к Е1 ВГС после предварительного иммуноосаждения с anti-E1. Клеточный лизат очищали центрифугированием через 30% сахарозную подушку. 1 – E1E2 дикий тип;

2 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N1; 3 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N5; 4 – E1mutE2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1 и N5; 5 – E1mutЕ2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4; 6 – E1mutE2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1, N2, N3 и N4; 7 – E1mutЕ2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4 и N5; 8 – E1mutE2 с мутацией во всех сайтах гликозилирования; WT- бакуловирус дикого типа.

Нарушение сайтов гликозилирования приводило, как и ожидалось, к повышению электрофоретической подвижности гликопротеина Е1 в денатурирующем 12% ПААГ.

Обработка мутантных гликопротеинов Е1 эндогликозидазой EndoH с последующим вестерн-блот анализом показали, что синтезированные в клетках насекомых мутантные гликопротеины, как и природный белок, чувствительны к последней (Рис.29).

Рис. 29. Вестерн-блот анализ экспресии мутантных белков Е1 в комбинации с Е2 ВГС в клетках насекомых Sf9 с антителами к Е2 ВГС. Клеточный лизат очищали центрифугированием через 30% сахарозную подушку. 1 – E1mutE2 с дополнительным сайтом гликозилирования N6 в позиции 325 а.к;

2 – E1E2 дикий тип; 3 – E1E2 дикий +EndoH; 4 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N1;

5 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N1+EndoH; 6 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N1+ Tunicamycin; 7 – E1mutE2 с мутацией в сайте гликозилирования N5;

8 – E1mutE2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1 и N5; 9 – E1Е2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4; 10 – E1mutE2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1, N2, N3 и N4;

11 – E1Е2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4 и N5; 12 – E1mutE2 c мутацией в сайтах гликозилирования N1, N2, N3 и N5; 13 – E1mutE2 с мутацией во всех сайтах гликозилирования; WT- бакуловирус дикого типа.

Анализ экспрессии мутантных белков Е1 в комбинации с Е2 ВГС в клетках насекомых Sf9 подтвержден также иммунопреципитацией с антителами к калнексину и калретикулину.

Полученные результаты показали, во-первых, что мутантные белки Е1 экспрессируются в клетках насекомых; во-вторых, нарушение сайтов гликозилирования N2, N3, N4 в различных комбинациях не влияет заметным образом на эффективность экспрессии гликопротеина Е1, но снижает эффективность формирования нековалентного продуктивного комплекса Е1Е2; в-третьих, что введение дополнительного сайта гликозилирования N7 или нарушение сайта N4 в Е1 не влияет на характер гликозилирования белка и образование продуктивного гетеродимера Е1Е2; в-четвертых, чтоповреждение сайтов гликозилирования N1 или N5 в белке Е1 нарушает сборку продуктивного комплекса Е1Е2. В результате обнаружено, что отсутствие углеводных цепей в сайтах гликозилирования N1 и N5 влияет на образование нековалентного комплекса Е1Е2 ? прототипа природного комплекса, входящего в состав вириона ВГС.

Полученные нами результаты показывают, что дальнейшее исследование N-гликозилирования оболочечных белков Е1, Е2 ВГС позволит уточнить роль углеводных цепей в образовании комплекса Е1Е2 и его функционировании в инфекционном цикле вируса.

9.3. Исследование влияния новых синтетических ингибиторов ?-глюкозидазы на

процессинг структурных белков вируса гепатита С и формирование вириона ВГС.

Вирус гепатита С инфицирует более 3% населения во всем мире. В настоящее время нет оптимальных методов лечения и вакцины для профилактики этой инфекции. Уникальные особенности вируса гепатита С, такие как, большая изменчивость, высокая геномная вариабельность, способность к преодолению иммунного ответа, но, при этом, низкая эффективность репликации вируса в культуре клеток и отсутствие подходящих клеточных культур и животных моделей затрудняют исследования жизненного цикла и репликации вируса и сдерживают поиск ингибиторов инфекции. Воздействие на вирусный морфогенез может быть использовано в качестве альтернативного подхода к существующим стратегиям блокирования вируса гепатита С.

Во время N-гликозилирования белка цепь N-гликанов гликопротеина претерпевает серию модификаций внутри эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, в которых участвуют ?-глюкозидаза и ?-маннозидаза. Производные иминосахаров, способные блокировать действие ?-глюкозидазы или ?-маннозидазы, и, как следствие, нарушающие процесс внутриклеточного N-гликозилирования гликопротеинов, могут нарушать правильное складывание и сборку вирусных оболочечных белков, блокируя вирусный морфогенез и, в результате, снижать инфекционность вируса. Такие соединения могут быть потенциальными антивирусными агентами. В качестве потенциальных ингибиторов ?-глюкозидазы могут быть использованы производные аналога глюкозы – дезоксиноиримицина (DNJ), блокирующие действие ?-глюкозидазы. Для проверки этого предположения были синтезированы алкилированные производные DNJ: N-пентил-DNJ и N-бензилl-DNJ. ( Бакиновский Л.В. и Зинин А.А., ИОХ РАН) (Рис.33).

Рис. 30. Иминосахара, алкилированные производные аналога глюкозы дезоксиноиримицина DNJ

Для изучения влияния этих соединений на гликозилирование структурных белков ВГС, на процесс сборки структурных белков, на инфекционность вирусных частиц и на способность вируса связываться с клеткой использовали вирусоподобные частицы ВГС, образующиеся в клетках насекомых и млекопитающих. Отобранные в этих системах соединения могут стать основой для разработки новых противовирусных препаратов.