DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций


Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе

Стариков Юрий Витальевич, 17.10.2010

 

L-аргинином Нейтрофилы, инкубированные с

Лазерная проточная цитофлуориметрия

Нейтрофилы в стадии раннего апоптоза 32 32 22 22 54 54 54

Уровень АФК в клетке 32 32 22 22 54 54 54

Концентрация Ca2+ в клетке 22 22 22 22 54 54 54

Спектрофотометрический анализ

Концентрация метаболитов NO 22 22 22 22 54 54 54

Радиоимуннный анализ

Концентрация цАМФ в клетке 7 7 6 7 14 15 17

Концентрация цГМФ в клетке 7 7 8 9 14 16 14

Вестерн-блоттинг

Содержание Bax

в клетке 3 3 3 3 3 Не

определяли Не

определяли

Содержание Bcl-2

в клетке 3 3 3 3 3 Не

определяли Не

определяли

Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в двойном градиенте плотности Ficoll-Paque (?=1,077 г/см3) («GE Healthcare», Швеция) и Ficoll-урографина (?=1,095 г/см3) (урографин – «Schering», Россия). Клетки культивировали в полной питательной среде [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992] в стерильных пенициллиновых флаконах (для определения концентрации конечных метаболитов оксида азота, содержания белков Bcl-2, Bax, концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах) и 96-луночных круглодонных иммунологических планшетах (для определения числа аннексин-положительных клеток, концентрации внутриклеточных АФК и цитоплазматического кальция методом проточной лазерной цитометрии) в течение 18 ч при температуре 37? С и 5

Методом лазерной проточной цитометрии с использованием цитометра Epics XL («Beckman Coulter», Франция) оценивали число аннексин-положительных клеток в культуре, содержание АФК и Са2+ в нейтрофилах. Оценка реализации программированной гибели нейтрофилов крови осуществляли с помощью набора реагентов «ANNEXIN V FITC» («Beckman Coulter», Франция) методом, основанным на способности аннексина V, меченного флуоресцеин изотиоцианатом, связываться с фосфатидилсерином, появляющимся на мембране клеток при запуске программы апоптоза [Van Engeland M. et al., 1998]. Концентрация внутриклеточных АФК определялась с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией – дихлорфлюоресцеина диацетата («Sigma», США) [ HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22B ass%20DA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_Result sPanel.Pubmed_RVAbstractPlus" Bass D.A . et al., 1983]. Оценка концентрации ионов кальция в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов проводилась методом, основанным на определении интенсивности флуоресценции липофильного зонда Fluo 3 AM («MP Biomedicals TM», США), проникающего в клетку и связывающего ионы кальция [ HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22M erritt%20JE%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_Res ultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus" Merritt J.E . et al.,1990].

Спектрофотометрический метод определения содержания нитритов в супернатантах был основан на цветной реакции с реактивом Грисса (1 % сульфаниламид («MP», США), 0,1 % нафтилендиамин («MP», США), разведенные в 12 % уксусной кислоте) [Green L.C. et al., 1982].

Определение содержания циклических нуклеотидов цАМФ и цГМФ в нейтрофилах крови проводили с использованием метода конкурентного твердофазного радиоиммунного анализа [Yallow R.S., Berson S.A., 1970], при помощи наборов «RIA AMPc/cAMP» и «RIA сGMP» («Immunotech», Франция). Методические детали проведения радиоконкурентного анализа описаны в протоколах фирмы-изготовителя для каждого радиоиммунного комплекта.

С помощью метода вестерн-блоттинга в нейтрофилах определяли содержание белков Bcl-2 и Bax [Towbin H. et al., 1979]. Клеточные экстракты получены путем лизиса клеток в фосфатно-солевом буфере, содержащем 50 мМ трис-НCl буфер (рН=6,5), 100мМ дитиотреитол, 2% SDS, 0,1% бромфеноловый синий, 15% глицерол («Helikon», США), смесь протеазных ингибиторов («Sigma», США). Белки разделяли по молекулярной массе под действием электрического поля в течение 60 мин при напряжении поля 120 В. Для последующего исследования белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США). Перенос белков осуществлялся электрофоретически в течение 90 мин при силе тока 60 мА. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу (антитела фирмы «Chemicon», США), выражая содержание белка Вах как отношение сигнала определяемого белка к сигналу белка глицеро-3-фосфат-дегидрогеназы в исследуемых образцах.

При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания и проверки статистических гипотез [Лакин Г.Ф., 1980]. Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение и ошибка среднего или медиана, первый и третий квартили. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента. В случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между зависимыми выборками применяли непараметрический критерий Вилкоксона. С помощью рангового критерия Манна-Уитни оценивали достоверность различий независимых выборок. Наличие связи между изучаемыми показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности программированной гибели нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

Отсутствие в научной литературе данных, свидетельствующих об изменениях метаболизма нейтрофилов в зависимости от концентрации перекиси водорода in vitro, наличие различных способов индикации фенотипических проявлений апотоза и некроза определили задачу экспериментального подбора оптимальной концентрации Н2О2, способной эффективно индуцировать как развитие окислительного стресса (ОС), так и программированную гибель нейтрофильных лейкоцитов.

Для моделирования окислительного стресса in vitro нейтрофилы, полученные у здоровых доноров, инкубировали с перекисью водорода в конечной концентрации 1, 5, 10 и 50 мМ.

В ходе проведенного нами исследования было установлено, что Ооптимальной конечной концентрацией Н2О2, вызывающей нарастание внутриклеточной продукции АФК и индуцирующей апоптоз наибольшего числа нейтрофильных лейкоцитов, но не стимулирующей развитие некротических изменений нейтрофилов, является 5 мМ (рис 1). В ходе дальнейших исследований именно эта концентрация была использована для моделирования ОС in vitro.

В ходе выполненного нами исследования, для подтверждения адекватности выбранной нами модели окислительного стресса было проведено сравнение внутриклеточного содержания АФК в условиях экспериментальной модели окислительного стресса (5 мМ Н2О2) и при остром воспалении. В данных группах количествоБыло выявлено, что содержание АФК в культуре нейтрофильных лейкоцитов лейкоцитах, полученных у больных внебольничной пневмонией (0,653(0,574–0,728) усл.ед.) и острым аппендицитом (0,673(0,561–0,690) усл.ед.)) значимо превышало контрольные величины (р<0,05) и статистически не отличалось от значений в экспериментальной модели (р>0,05). Этот факт, на наш взгляд, свидетельствует друг от друга. Отсутствие различий по уровню концентраций внутриклеточных АФК в клетках, культивируемых с 5 мМ перекисью водорода и клетках, полученных от больных с острым воспалением, свидетельствует об адекватности использованной в работе модели ОС и подобранной концентрации Н2О2 для имитации поведения нейтрофилов при развитии острого воспаления. Отсутствие различий содержания внутриклеточных АФК в нейтрофилах у больных острым аппендицитом и внебольничной пневмонией позволило нам объединить пациентов в одну клиническую группу с острым воспалительным процессом.

Рис. 1. Содержание внутриклеточных АФК, количество аннексин-положительных и некротизированных клеток в культуре нейтрофильных лейкоцитов при инкубации с разными концентрациями перекиси

Сходная ситуация отмечается отмечалась при сравнении количества аннексин-положительных клеток в этих экспериментальной и клинических группахах, что указывает на близкий механизм активации апоптоза нейтрофилов, культивируемых в присутствии 5 мМ перекиси водорода in vitro, и нейтрофилов, полученных у больных с острым воспалением. Число апоптотических апоптотически измененных клеток в культуре нейтрофилов, полученных у пациентов с внебольничной пневмонией (62,37(54,25–69,20)%) и у больных острым аппендицитом (57,40(51,37–62,37)%), достоверно превышает превышало контрольную величину (р<0,05) и не отличалось от его значения при экспериментальном ОС (р>0,05). Количество клеток с пермеабилизированной мембраной в культуре нейтрофилов, полученных у больных внебольничной пневмонией (5,50(4,30–6,50) %), статистически превышало (p<0,05) контрольную величину; значения данного параметра в культуре нейтрофильных лейкоцитов, выделенных из крови у больных острым аппендицитом (4,20(3,80–5,70)%), оставалось в пределах контрольных величин (р>0,05).

в клетках, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями (r=0,71, p<0,05).

2. Влияния оксида азота на апоптоз нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

Известно, что оксид азота является, с одной стороны, одним из компонентов окислительного стресса, с другой – важнейшим медиатором клеточного метаболизма [Зенков Н.К., и соавт., 2001 Tuteja N. et al., 2004]. Для установления роли NO в механизмах регуляции апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе в параллельных экспериментах клетки культивировали в присутствии индуктора или ингибитора NO-синтазы.

Изучение концентрации конечных метаболитов NO в среде инкубации нейтрофилов показало, что под действием 5 мМ Н2О2 происходит статестически значимое увеличение продукции оксида азота по сравнению с интактной культурой (p<0,05), что в целом согласуется с данными литературы [Thomas S. R., 2002] (рис. 2). Оценка концентрации метаболитов оксида азота в культуре нейтрофилов, полученных у пациентов с острым воспалением, выявила увеличение значений исследованного показателя в 1,5 раза по сравнению с таковыми в интактной культуре клеток у здоровых доноров (р<0,05) и в 1,3 раза по сравнению со стресс-контролем (р<0,05) (рис. 2).

Было установлено, что при культивировании нейтрофилов в присутствии L-аргинина способствует повышению концентрации метаболитов NO достоверно повышается. Культивирование нейтрофильных лейкоцитов с L-NAME приводило к снижению концентрации метаболитов оксида азота при экспериментальном ОС до контрольных значений. При работе с нейтрофилами, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, воздействие ингибитора NO-синтазы приводило к снижению концентрации метаболитов NO до базового уровня, характерного для клеток при остром воспалении. Данный факт свидетельствует о запуске как ферментативного, так и неферментативного механизмов наработки оксида азота, нечувствительных к воздействию L-NAME, в условиях воспалительного процесса [Реутов В.П. и соавт., 1998; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2000; Beltran B. et al. 2000, 2002].

В результате проведенного исследования было установлено, что L-аргинин не влияет на содержание АФК в цитозоле нейтрофилов ни при ОС in vitro, ни у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями. Увеличение уровня АФК отмечалось лишь при добавлении ингибитора NO-синтазы в условиях экспериментального окислительного стресса (р<0,05).

При оценке количества апоптотически измененных клеток оказалось, что L-аргинин эффективно снижал число аннексин-положительных нейтрофилов в культурах с моделированием ОС in vitro до уровня, не отличавшегося от контрольных значений (р>0,05). Исследование чувствительности нейтрофилов крови, полученных у больных с острым воспалением, к воздействию индуктора синтеза оксида азота не позволило выявить изменений количества апоптозных клеток по сравнению с культурой нейтрофилов, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, не подвергавшейся воздействию L-аргинина (рис. 2).