DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций


КИНЕТИКА МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОБОНЯТЕЛЬНОЙ ВЫСТИЛКИ ТРАВЯНОЙ ЛЯГУШКИ (Rana temporaria) ПОД ДЕЙСТВИЕМ ОДОРАНТОВ

Руденко Яков Николаевич, 16.06.2007

 

5. Установить зависимость двигательной активности обонятельных жгутиков от ее энергетического обеспечения.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

Одоранты, в обонятельную трансдукцию которых вовлечены системы вторичных мессенджеров (амиловый спирт, цинеол, камфора и ванилин), активируют сукцинатдегидрогеназу (СДГ).

Кинетические параметры изменений Ca2+-аккумулирующей способности клеточных мембран обонятельной выстилки, происходящих под действием амилового спирта, цинеола, камфоры и ванилина, коррелируют с аналогичными показателями динамики флуоресценции НАДН.

Кинетика флуоресценции НАДН и мембраносвязанного кальция различна для амилового спирта, цинеола, камфоры и ванилина, что обусловлено участием разных внутриклеточных сигнальных систем в трансдукции этих одорантов.

Кинетика реакций мембраносвязанного кальция, а также НАДН и ФП на стимуляцию обонятельной выстилки аммиаком и ?-меркаптоэтанолом отличается от кинетики реакций на амиловый спирт, цинеол, камфору и ванилин, что объясняется разными механизмами трансдукции этих одорантов.

Неодинаковая кинетика собственной флуоресценции НАДН, ФП и Ca2+-аккумулирующей способности клеточных мембран обонятельной выстилки на различные одоранты подтверждает основные положения теории гетерогенности хемосенсорных систем.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые исследована кинетика флуоресценции НАДН и ФП в рецепторных клетках обонятельного эпителия лягушки в ответ на стимуляцию амиловым спиртом, цинеолом, камфорой и ванилином, а также аммиаком и ?-меркаптоэтанолом.

При изучении реакций на амиловый спирт, цинеол, камфору и ванилин впервые выявлена взаимосвязь кинетики флуоресценции НАДН с кинетикой Ca2+-аккумулирующей способности клеточных мембран в обонятельной выстилке. Кинетические показатели для разных одорантов оказались различными, что обусловлено гетерогенностью молекулярных механизмов их трансдукции.

Впервые показано, что скорость нарастания интенсивности вторичной флуоресценции комплекса: Ca2+-хлортетрациклин-клеточная мембрана (Ca2+-ХТЦ-КМ) под действием амилового спирта, цинеола, камфоры и ванилина примерно в три раза превосходит аналогичный показатель собственной флуоресценции НАДН. Аммиак в сравнении с другими одорантами вызывает наиболее длительные реакции усиления флуоресценции мембраносвязанного кальция.

При сопоставлении скорости усиления собственной флуоресценции НАДН и ФП в обонятельной выстилке лягушки под действием амилового спирта, цинеола, камфоры и ванилина с аналогичным показателем в гепатоцитах крысы, стимулированных гормонами (Hajnoczky et al., 1995), впервые установлено, что кинетика метаболических процессов в обонятельных клетках пойкилотермного животного в 4–5 раз выше, чем в гепатоцитах гомойотермного.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Работа имеет важное теоретическое значение для развития физиологии и биофизики хемосенсорных систем, так как расширяет представление о гетерогенности хеморецепции. Гетерогенность обоняния проявляется в том, что одоранты, вовлекающие в трансдукцию разные биофизические и биохимические механизмы, обладают различной кинетикой развития метаболических процессов в обонятельных клетках. Научно-теоретические положения и выводы из работы могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах физиологии в высших учебных заведениях медицинского и биологического профиля.

На основе полученных в нашей работе данных по кинетике метаболических процессов в обонятельных клетках под действием одорантов могут быть разработаны новые медицинские технологии для диагностики и лечения тех форм патологии обоняния, которые связаны с нарушением функционирования митохондрий в рецепторных клетках обонятельного эпителия, а также установлены предельно допустимые концентрации аммиака и сероводорода в воздухе рабочих помещений для некоторых отраслей промышленности.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследования докладывались на IV Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005), Международном симпозиуме, посвященном 80-летию организации Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы адаптивного поведения» (Санкт-Петербург, 2005); XIII международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); XIX Всероссийском научном совещании «Актуальные проблемы учения о тканях» (Санкт-Петербург, 2006); IV международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2006); Международной конференции Atlanta 2006: Mastering the Mitochondrial Maze (Атланта, США, 2006); 14-th European Bioenergetic Conference (Москва, 2006); Международной конференции Chinese Mit’ 2006: Mitochondria and Health (Вэнжоу, Китай, 2006); Международной конференции «МЕТРОМЕД 2007» (Санкт-Петербург, 2007).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 3 статьи в рецензируемых журналах и 10 тезисов докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 134 страницы машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 271 литературный источник, из которых 47 на русском языке и 224 – на иностранном.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили на изолированной обонятельной выстилке лягушки Rana temporaria. Для исследования флуоресценции комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ, а также НАДН и ФП обонятельную выстилку стимулировали струей увлажненного воздуха, содержащей насыщенные пары природной тертой d-камфоры (Реахим), цинеола (MP, США), амилового спирта (Реахим), ванилина (MP, США). Кроме того, изучали реакции обонятельной выстилки на 1 % раствор аммиака (Реахим) в дистиллированной воде и водный раствор (-меркаптоэтанола (Fluka, Германия) в разведении 1:1000, выделяющего сероводород.

Интенсивность собственной флуоресценции НАДН и ФП в обонятельных клетках измеряли на установке для флуориметрического анализа, изготовленной на основе двулучевого люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-Р8. Флуоресценцию возбуждали на длине волны 365 нм, а регистрировали – на длине волны 465 нм (НАДН) и в области 520 – 530 нм (ФП) (Карнаухов, 1978). Одновременно записывали электроольфактограмму. Амплитуду реакций на одоранты оценивали по отношению изменения флуоресценции в ответ на подачу стимула (?R) к уровню флуоресценции до воздействия одорантом (R0).

Динамику вторичной флуоресценции комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ изучали с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-МП. Флуоресценцию возбуждали ртутной лампой ДРШ-250М (?max = 390 нм), свечение препарата регистрировали на 520 нм (Владимиров, Добрецов, 1980). Скорость нарастания начального линейного участка реакций комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ, а также НАДН и ФП считали как долю реакции (в %) от ее максимальной величины, достигаемую за 1 с (Hajnoczky et al., 1995).

При прижизненной телевизионной микроскопии одоранты добавляли непосредственно в раствор Рингера, омывающий обонятельную выстилку, в следующих концентрациях: ванилин 10-4 М, цинеол и камфора 10-5 М, амиловый спирт и аммиак 1:1000, (-меркаптоэтанол 1:10000.

Фармакологический анализ проводили с использованием ротенона (MP, США) и малоната натрия (Sigma, США). Ротеноном (5 мкМ) ингибировали первый комплекс ДЦ митохондрий, а малонатом (50 мМ) – СДГ.

Достоверность различий оценивали с помощью программы Origin 7.5, применяя парный или независимый двухвыборочный t-тест (p = 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Все использованные в работе одоранты были разделены на две группы (Бигдай, 2004; Бигдай, Самойлов, 2004). В первую группу входили амиловый спирт, цинеол, камфора и ванилин, вовлекающие в рецепцию внутриклеточные сигнальные системы. Вторую группу составляли аммиак и ?-меркаптоэтанол, проникающие внутрь рецепторных клеток и действующие непосредственно на митохондрии.

???y????b?флуоресценции НАДН и ФП было установлено, что интенсивность флуоресценции НАДН также увеличивалась под действием всех одорантов первой группы, тогда как свечение ФП усиливалось только под действием амилового спирта. Можно предположить, что увеличение интенсивности флуоресценции НАДН происходит в результате повышения снабжения ДЦ митохондрий восстановленными эквивалентами за счет активации Ca2+-зависимых дегидрогеназ цикла Кребса и СДГ.

При стимуляции одорантами первой группы скорость нарастания флуоресценции комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ была примерно в 3 раза выше, чем аналогичный показатель свечения НАДН и ФП (рис. 1 А, В). В наших экспериментах при стимуляции обонятельного эпителия веществами с прогорклым, эвкалиптовым, камфорным и цветочным запахами за 1 с реакция мембраносвязанного Ca2+ достигала 55–75% своей амплитуды, а НАДН и ФП – 20–30%. Вместе с тем показано, что содержание вторичных мессенджеров (цАМФ и IP3) в обонятельных жгутиках достигает максимума через 25–50 мс (Breer et al., 1990; Restrepo et al., 1993; Jaworsky et al., 1995). Таким образом, при передаче сигнала от рецептора к митохондриям происходит поэтапное замедление кинетики: образование вторичных мессенджеров происходит быстрее темпов усиления флуоресценции комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ, что, в свою очередь, развивается быстрее флуоресцентных реакций НАДН.

Скорость нарастания собственной флуоресценции НАДН была наибольшей при стимуляции обонятельной выстилки цинеолом и ванилином, причем различия с реакциями на амиловый спирт были достоверны (рис. 1 B). Можно предположить, что различия в скорости нарастания интенсивности флуоресценции НАДН для разных одорантов первой группы свидетельствуют о неодинаковой степени активации ими Ca2+-зависимых дегидрогеназ (Nichols et al., 1994; Hajnoczky et al., 1995; Rutter et al., 1996), которая больше зависит от

Рис. 1. Сравнение скорости нарастания интенсивности флуоресценции (A, B, C) и продолжительности (D, E, F) реакций на различные одоранты: A, D – комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ; B, E – НАДН; C, F – ФП. По оси абсцисс – сравниваемые одоранты; по оси ординат: A – скорость нарастания реакций комплекса Ca2+-ХТЦ-КМ, %/с; B – скорость нарастания реакций НАДН, %/с; C – скорость нарастания реакций ФП, %/с; D – продолжительность реакций комплекса Ca2+-ХТЦ-КМ, с; E – продолжительность реакций НАДН, с; F – продолжительность реакций ФП, с. Столбики на гистограммах B, C, E, F отсутствуют в тех случаях, когда реакций на одорант не было. Данные приведены как xср ± mxср, где xср – средние арифметические значение, а mxср – стандартная ошибка.

скорости нарастания концентрации цитозольного Ca2+, нежели от максимума его содержания и времени возвращения к исходному уровню (Hajnoczky et al., 1995). Может быть, поэтому тенденция к появлению различий в скорости нарастания флуоресценции комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ при стимуляции обонятельной выстилки одорантами первой группы переходит в закономерность в скорости нарастания флуоресценции НАДН. По крайней мере, для одорантов первой группы существует зависимость между различиями в скорости усиления флуоресценции НАДН и комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ (рис. 1 А, В).

Неодинаковые темпы активации метаболизма одорантами первой группы, вероятно, обусловлены различной скоростью передачи сигнала от рецепторов к одорантам до ДЦ митохондрий обонятельных клеток вследствие гетерогенности их молекулярных механизмов трансдукции. Трансдукцию сигнала от рецептора до аденилатциклазы (АЦ) при восприятии амилового спирта или до фосфолипазы (ФЛС) в ответ на стимуляцию ванилином осуществляет G-белок, а при рецепции цинеола и камфоры, относящихся к группе терпеновых углеводородов, трансдукция сигнала от цинеола до АЦ или от камфоры до ФЛС осуществляется за счет рецепторной тирозинкиназы (Бигдай, 2004; Бигдай, Самойлов, 2004). Гетерогенность может проявляться, например, в том, что аденилатциклазная и фосфоинозитидная системы активируют различные кальциевые каналы. Предполагаемые нами механизмы действия одорантов первой группы на ДЦ обобщены в рис. 2.

При стимуляции обонятельных клеток веществами с прогорклым, эвкалиптовым, камфорным и цветочным запахами продолжительность реакций НАДН и ФП была в несколько раз больше, чем реакций комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ, причем длительность ответов НАДН на амиловый спирт была достоверно больше, чем на ванилин, камфору и цинеол, и коррелировала с более продолжительным усилением свечения комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ (рис. 1 D, E, F). Более продолжительные реакции НАДН на амиловый спирт, по-видимому, указывают на перегрузку ДЦ митохондрий восстановленными эквивалентами, что, вероятно, является следствием более длительной активации Ca2+-зависимых дегидрогеназ (Nichols et al., 1994; Hajnoczky et al., 1995; Rutter et al., 1996).

При блокаде первого комплекса ДЦ ротеноном реакции НАДН на одоранты первой группы сохранялись. Однако после обработки обонятельной выстилки малонатом они исчезали. Следовательно, вещества с прогорклым, эвкалиптовым, камфорным и цветочным запахами активируют ротенон-резистентный путь, переключая ДЦ митохондрий на окисление сукцината, что способствует увеличению скорости синтеза АТФ митохондриями (Кондрашова,

Рис. 2. Предполагаемый механизм активации ДЦ митохондрий обонятельных клеток амиловым спиртом, цинеолом, камфорой и ванилином.

Скорость нарастания флуоресценции комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ, НАДН и ФП в обонятельных клетках под действием одорантов первой группы, установленная в наших опытах, выше аналогичных показателей кинетики длягепатоцитов крысы, стимулированных вазопрессином и ангиотензином II (Hajnoczky et al., 1995). Так, средняя скорость нарастания флуоресценции НАДН и ФП обонятельной выстилки была в 4–5 раз выше аналогичных показателей для гепатоцитов. Заметим, что исследования действия гормонов проводились на клетках печени млекопитающего, которые обладают очень активным метаболизмом, тогда как наши эксперименты были выполнены на обонятельных клетках амфибий при температуре 22 – 25оС. Тем не менее, скорость развития метаболических реакций в органе обоняния пойкилотермной лягушки была выше, чем в гепатоцитах гомойотермной крысы.

Обдувание обонятельного эпителия аммиаком и сероводородом также усиливало флуоресценцию комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ, причем продолжительность реакций на аммиак была в несколько раз больше, чем на одоранты первой группы (рис. 1 D). Вместе с тем при стимуляции обонятельной выстилки аммиаком интенсивность флуоресценции НАДН усиливалась в 100% случаев, а свечение ФП становилось сильнее в 56% опытов. На фоне ротенона (5 мкМ) амплитуда реакций НАДН на аммиак снижалась, и отмечалась выраженная тенденция к уменьшению их продолжительности. Конкурентный характер взаимодействия аммиака и ротенона подтверждает предположение об их сходном действии на ДЦ митохондрий. Обдувание обонятельной выстилки (-меркаптоэтанолом не вызывало изменений интенсивности флуоресценции НАДН и ФП, что может быть обусловлено блокированием железосодержащих центров на всем протяжении ДЦ митохондрий.

Предположения относительно механизмов действия одорантов первой и второй групп на метаболизм обонятельных клеток мы проверяли в экспериментах по исследованию подвижности обонятельных жгутиков. На фоне ротенона (5 мкМ) или малоната (50 мМ) неупорядоченные движения жгутиков прекращались. Последующая стимуляция амиловым спиртом, ванилином, камфорой и цинеолом на фоне действия ротенона (5 мкМ) всегда восстанавливала цилиарную подвижность, тогда как после обработки малонатом (50 мМ) этого не происходило. Аммиак и (-меркаптоэтанол угнетали двигательную активность обонятельных жгутиков.

Таким образом, в данной работе впервые изучена кинетика флуоресценции НАДН и ФП в обонятельных рецепторных клетках и ее связь с кинетикой флуоресценции комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ. Можно предположить, что в основе различной кинетики реакций НАДН и комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ, а также различий в изменениях двигательной активности обонятельных жгутиков под действием различных одорантов лежит гетерогенность молекулярных механизмов их обонятельной трансдукции. Результаты нашей работы подтверждают теорию гетерогенности хемосенсорных систем (Самойлов, 1983), которая получила дальнейшее развитие благодаря фактам о гетерогенности обонятельной трансдукции (Бигдай, 2004).

1. Вещества, обладающие прогорклым, эвкалиптовым, камфорным, цветочным и острым запахом, усиливают в обонятельных клетках вторичную флуоресценцию комплекса: Са2+-хлортетрациклин-клеточная мембрана, а также собственную флуоресценцию НАДН, причем скорость усиления флуоресценции комплекса: Са2+-хлортетрациклин-клеточная мембрана примерно в 3 раза выше, чем

2. Одоранты первой группы (амиловый спирт, цинеол, камфора и ванилин) активируют дыхательную цепь митохондрий посредством стимуляции внутриклеточных сигнальных систем и сопряженной с этим активацией сукцинатдегидрогеназы.