DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 16.02.2008

Материалы

загрузка...

Участие активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола

Науменко Екатерина Анатольевна, 16.02.2008

 

У микроорганизмов из различных таксономических групп выявлены различия качественных и количественных характеристик генерации активных форм кислорода в ответ на контакт клеток с 2,4,6-тринитротолуолом

Трансформация 2,4,6-тринитротолуола клетками различного уровня организации сопряжена с изменением клеточной поверхности как барьера проницаемости

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на школах-конференциях молодых ученых “Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии” (Пущино-Тула, 2006) и “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2004, 2005, 2006, 2007), “Ломоносов-2007” (Москва,2007), научных конференциях “Биотехнология – охране окружающей среды” (Москва, 2004, 2005, 2006), “Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии” (Казань, 2004), “Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития” (Киров, 2007), “Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии” (Екатеринбург-Пермь, 2007), “Биосистемы: организация, поведение, управление” (Нижний Новгород, 2007), международной конференции “Modern development of magnetic resonance” (Kazan, 2007), а также на итоговых конференциях КГУ (2005-2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы.

Благодарности. Выражаю глубокую признательность моему научному руководителю Наумовой Римме Павловне за разработку интересной научной темы и внимательное отношение к работе. Благодарю всех тех, кто помогал мне в работе над диссертацией: Гафарова Арслана Булатовича за помощь в идентификации микроорганизмов, Силкина Николая Ивановича и Родионова Александра за проведение ЭПР-спектроскопии, Шурхно Равилю Абдулловну за помощь в проведении ВЭЖХ, Гордона Льва Хаймовича и Валитову Юлию Наильевну за предоставление возможности постановки манометрических опытов и обсуждение полученных результатов, Сальникова Вадима Владимировича и Мухитова Александра Ринатовича за помощь в проведении флуоресцентной микроскопии, Румянцеву Наталью Ивановну за предоставление культуры растительных клеток, а также коллектив Лаборатории экологической биотехнологии и биомониторинга, в особенности Ложкина Андрея Петровича и Зиганшина Айрата Мансуровича, а также студентов – Субхангулову Айгуль Расыковну и Сырову Анну Викторовну. Отдельная благодарность инженерам кафедры микробиологии – Мочаловой Наиле Касимовне и Пономаревой Альфие Зарифовне.

Структура и объем диссертации Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 37 рисунков. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 195 источников, из них 169 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактериальные штаммы и культура растительной ткани. В работе использовали репрезентативные штаммы ТНТ-трансформирующих микроорганизмов Bacillus cereus ZS18, Pseudomonas putida EN1582, выделенные из отходов нефтехимического производства, а также Lactobacillus plantarum IL1. Трансформацию ТНТ и образование АФК изучали также на клетках неморфогенного каллуса гречихи татарской Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn линии 1-10, полученной из незрелого зародыша и состоящей из клеток паренхимного типа [Румянцева с соавт., 1992, 1998].

Определение видовой принадлежности бактериальных штаммов

Выделение геномной ДНК. Микроорганизмы выращивали на соответствующих твердых питательных средах (Bacillus sp. и Pseudomonas на среде МПА, Lactobacillus sp. на среде МРС (DeMan-Rogosa-Sharpe) [De Man et al., 1960]). Выделение ДНК проводили согласно стандартной процедуре miniPrep.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для проведения ПЦР использовали смесь следующего состава: 200 мкM dNTP, 1.5 мM MgCl2, 200 пкM праймеров (forward primer 63f (CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC), reverse primer 1387r (GGG CGG WGT GTA CAA GGC), 1324 bp) [Marchesi, et al., 1998], 2.5 мкл буфера 10X, 0.5 ед ДНК-полимеразы. В кюветы для ПЦР вносили 24 мкл данного раствора и 1 мкл образца ДНК. Для проверки успешности процесса использовали стандартные маркеры.

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 2400 (PerkinElmer, США) по следующей программе: денатурация: 94оС 5 мин; денатурация:94оС, 2 мин; отжиг: 55оС, 30 сек; наращивание72оС, 2 мин (30 циклов); завершение: 72оС, 7 мин;

подготовка к хранению: 10оС.

Секвенирование продукта ПЦР. Секвенирование проводили на секвенаторе Beckman Coulter CEQ 2000XL по стандартной процедуре согласно протоколу Beckman. Установленные нуклеотидные последовательности 16S рДНК синтезированной на матрице 16S рРНК изучаемых штаммов сравнивали с последовательностями базы данных GenBank и RibosomalDataBaseProjectII.

Трансформация ТНТ клеточными суспензиями бактерий. Бактерии предварительно культивировали до поздней экспоненциальной фазы роста. Клетки осаждали центрифугированием (9000g, 15 мин), дважды отмывали 30мМ Na2HPO4 / 20 мМ KH2PO4 (рН 7.0) и ресуспендировали в ТНТ-содержащем буфере до оптической плотности (А600) 0.1; 0.5 или 1.0. В опытах с мертвыми клетками отмытую клеточную суспензию предварительно выдерживали в водяной бане (1000С, 15 мин). С целью определения влияния хелатирующих агентов на процесс трансформации ТНТ клетки отмывали буфером, содержащим ЭДТА или 2,2`-бипиридил. ТНТ вносили перед автоклавированием до конечной концентрации 100 мг/л.

Трансформация ТНТ клеточными суспензиями каллусной ткани. Каллус предварительно культивировали на агаризованной среде RX [Румянцева с соавт., 1998]. Каллусные культуры поддерживали в термостате при температуре 26+ 20С, в темноте, на каллусогенной среде RХ, рН 5.5 – 5.6. Для получения клеточной суспензии каллусную массу переносили с агаризованной среды RX в 50мМ K-Na фосфатный буфер (рН 7.0), содержащий ТНТ. Инкубировали при 250С в аэрируемых условиях.

Трансформация ТНТ ферроцианидом (K4[Fe(CN)6]). Реакцию инициировали внесением K4[Fe(CN)6]*3H2O (10-2мМ) в 50мМ фосфатный буфер, содержащий ТНТ (100 мг/л). Об образовании феррицианида (K3[Fe(CN)6]) судили по увеличению поглощения при 320 нм.

Высокая эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов трансформации ТНТ. ВЭЖХ-анализ в освобождённых от клеток инкубационных смесях проводили на хроматографе Series 200 (Perkin Elmer, США), в обращенно-фазовом варианте с использованием колонки (150 х 4.60 мм C18, Phenomenex) с детектором длин волн при 254 нм. Элюцию проводили в изократическом режиме системой растворителей ацетонитрил-вода (40:60) при скорости 0.5 мл/мин и температуре 300С.

Определение потребления кислорода клеточными суспензиями. Потребление кислорода определяли манометрическим методом Варбурга. Потребление О2 инкубационными смесями с плотностью бактериальной суспензии А600= 2.0 измеряли в том же буфере при концентрациях ТНТ 50 и 100 мг/л.

Определение активных форм кислорода (АФК)

Определение супероксидного анион-радикала (О2•) адренохромным методом. К 2 мл освобождённой от клеток инкубационной жидкости добавляли 200 мкл 0.1% водного раствора гидрохлорида эпинефрина и после 15-минутной инкубации проводили измерения при 480 нм против освобожденной от клеток неокрашенной инкубационной жидкости на спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer, США).

ЭПР-спектрометрия АФК. ЭПР-спектры супероксида регистрировали на спектрометре ESP-300 (Bruker, Германия), при комнатной температуре (~25°C), СВЧ мощность 50 мВт, СВ частота 9.8 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0.5 Гаусс. Tiron (50 мМ) добавляли к исследуемым растворам после отделения клеток, рН доводили до 9.5-10. Образцы в объеме 20 мкл помещали в стеклянные капилляры. Образование О2•– и гидроксильного радикала (•ОН) регистрировали также с применением спиновой ловушки DMPO при следующих параметрах ЭПР-спектрометрии: комнатная температура (~25°C), СВЧ мощность 20 мВт, модуляция поля 100 кГц, амплитуда ВЧ модуляции 1.0 Гаусс, константа времени 164 мсек. Аутентичные (эталонные) спиновые аддукты получали, применяя модельные системы образования АФК. Для генерации О2•– использовали ксантин-ксантиноксидазную реакцию. ОН генерировали в реакционной системе Фентона.

Определение физиологического статуса бактериальных и растительных клеток в процессе трансформации ТНТ

Определение клеточной проницаемости методом флуоресцентного окрашивания. Флуоресцентную микроскопию бактерий и клеток каллусной культуры проводили с применением конфокального лазерного флуоресцентного микроскопа LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия). Определение физиологического состояния растительных и бактериальных клеток в процессе трансформации ТНТ проводили с использованием двойного окрашивания двумя флуоресцентными красителями: пропидиум иодидом (PI) и 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлоридом (DAPI) [Shi et al., 2007]. Полученные изображения анализировали с помощью компьютерной программы Carl Zeiss Advanced Imaging Microscopy 4.0.

Определение жизнеспособности клеток культуральными методами. Для определения способности бактериальных клеток, подвергнутых воздействию ТНТ, к пролиферации проводили их высев на МПА на различных этапах трансформации ТНТ. Учет КОЕ и диаметра колоний проводили через 24, 48 и 72 ч. Способность к размножению культивируемых растительных клеток, взаимодействовавших с ТНТ, изучали высевом на агаризовнную среду RX отфильтрованных клеток, отобранных через 2 мин и 2 ч после начала трансформации ТНТ. Через 7 сут определяли уровень прироста сырой биомассы каллуса. Рост суспензионной культуры гречихи татарской в присутствии различных концентраций ТНТ проводили в темноте в условиях принудительной аэрации. Уровень прироста биомассы измеряли через 7 сут культивирования.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с использованием стандартного пакета Microsoft Office Excel 2007. Обработку данных ЭПР-спектроскопии проводили в программной среде Origin 7.5. Результаты представлены в виде средних значений со стандартными отклонениями (М±m). В экспериментах по флуоресцентному окрашиванию клеток представлены репрезентативные данные. Для оценки статистической значимости различий между опытной и контрольной выборками использовали критерий Стьюдента, принимая р?0.05 за достоверный уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение и идентификация микроорганизмов

Источниками выделения бактериальных штаммов, осуществляющих преимущественно восстановление нитрогрупп, служили почва, нефтехимические шламы и кисломолочные продукты. Были отобраны 3 штамма, однонаправленно трансформирующих ТНТ по пути нитроредукции с образованием изомерных ГАДНТ в качестве мажорных метаболитов, способные к росту при высоких концентрациях ТНТ (100-200 мг/л). На основании физиолого-биохимических признаков данные штаммы были предварительно отнесены к родам Bacillus (Bacillus sp. ZS 18), Pseudomonas (Pseudomonas sp. EN1582) и Lactobacillus (Lactobacillus sp. IL1). Для определения видовой принадлежности выделенных штаммов была проведена их идентификация с применением методов молекулярной биологии на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рДНК, комплементарной 16S

Секвенирование проводили по стандартной процедуре согласно протоколу фирмы Beckman. Результаты сравнения установленных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК изучаемых штаммов с последовательностями базы данных GenBank и RibosomalDataBaseProjectII позволили с вероятностью 89-99% идентифицировать штамм Bacillus sp. ZS18 как Bacillus cereus, штамм Pseudomonas sp. EN1582 как Pseudomonas putida, штамм Lactobacillus sp. IL-1 как Lactobacillus plantarum.

Трансформация ТНТ интактными бактериальными клетками

Скрининг ряда грамположительных и грамотрицательных штаммов показал, что внесение клеточной массы в инкубационную смесь или ростовую среду сопровождается убылью некоторого количества ТНТ. Это начальное снижение (в пределах 4-9 мг/л) могло быть связано либо с сорбцией ТНТ бактериальными клетками, либо с его трансформацией в пределах соответствующих концентраций. Отделение клеток от инкубационных смесей с последующей экстракцией эфиром или хлороформом не выявили присутствия ТНТ, связанного с клетками.

Проведенный ВЭЖХ-анализ инкубационных смесей после отделения клеток выявил в качестве основных метаболитов изомерные ГАДНТ. Причем, в случае L. plantarum IL-1 и P. putida EN1582 имело место практически стехиометрическое превращение ТНТ в ГАДНТ, не сопровождающееся образованием моноаминопроизводных в течение всего времени эксперимента (3 ч). Начальный этап трансформация ТНТ B. cereus ZS18 также не был сопряжен с образованием АДНТ, но после второго часа инкубации происходило дальнейшее восстановление ксенобиотика с появлением моноаминопроизводных в инкубационной смеси. При этом концентрации 4АДНТ была незначительной и составляла 6.5-8.3 мкМ (рис.1).

Рис. 1. ВЭЖХ инкубационной смеси при трансформации ТНТ (440 мкМ) интактными клетками Bacillus cereus ZS18 через 3 ч после начала инкубации.

Трансформация ТНТ термически инактивированными бактериальными клетками

Моментальная убыль некоторого количества ТНТ непосредственно после внесения клеток, позволила предполагать неферментативную природу начального этапа его трансформации бактериями. Для подтверждения данного предположения необходимо было испытать инактивированные бактериальные клетки, неспособные к росту на питательных средах.

Внесение в инкубационную смесь нежизнеспособных, термически инактивированных клеток B. cereus ZS18 способствовало менее масштабному, чем в варианте с интактными клетками, однако закономерному снижению концентрации ТНТ (рис.2).

Рис. 2. Динамика убыли ТНТ в процессе инкубации клеток B. cereus ZS18 (А600=1.0) в фосфатном буфере с ТНТ (100 мг/л): 1 – живые клетки + ТНТ; 2 – термически инактивированные клетки + ТНТ; 3 – ТНТ без клеток.

Характерно, что в процессе продолжительной инкубации таких клеток с ксенобиотиком обычно детектируемые с применением ВЭЖХ-анализа метаболиты, такие как ГАДНТ и АДНТ, не были выявлены.