DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 14.11.2010

Материалы

загрузка...

Иммунохимические показатели в клинической оценке черепно-мозговой и скелетной травмы

Коханов Александр Владимирович, 14.11.2010

 

Так как белки при низкой ионной силе буферного раствора не связывались с иммобилизованным на сефарозе через бензидиновый спейсер по бензольному кольцу эстрадиолом, что совпадает с известными данными (Терентьев А.А., 1990), мы попытались сорбировать белки на этой колонке в гидрофобном режиме, при высокой молярности стартового буфера (табл.5.).

Установлено, что все белки связывались с эстрадиол-бензидин-сефарозой как с гидрофобным сорбентом в 1М сульфате аммония, (если на 1 мл аффинного геля наносилось не более 10 мг белка) и десорбировались с колонки при уменьшении концентрации соли в последовательности: СА => АФП => ПЩФ => ТК => СБАГ (табл.5).

Аффинный сорбент эстрадиол-С-17-триазинхлорид-сефароза, созданный для выделения эстрогенсвязывающих белков при хроматографии стартовым буфером не связывал СА, АФП, ТК и ПЩФ, так как имеет слишком короткий триазиновый спейсер (Терентьев А.А., 1990), однако в данном режиме на нем адсорбировался СБАГ, который потом элюировался при добавлении в стартовый буфер 1 М NaCl или водонасыщенного бутанола на этом буфере.

Разработка технологии получения препарата СБАГ и транскортина из сыворотки беременных. Обнаруженные нами особенности поведения СБАГ и ТК на хроматографических носителях легли в основу разработанных нами методов одновременного выделения этих белков из пула (500 мл) сыворотки крови беременных III триместра (табл.6 и 7). Метод для обоих белков включает последовательную высаливающую, ионообменную, гидрофобную и аффинную хроматографию и не требует промежуточных этапов диализа и концентрирования.

Таблица. 6

Характеристика препарата СБАГ на этапах выделения.

Этап очистки Cодержание белка, мг Cодержание

продукта % Степень очистки Выход (%)

общий СБАГ

Исходный материал 31200 26,8 0,09% 1 100

Осаждение (NH4)2SO4 40% насыщения (осадок) 6736 28,0 0,42% 4,5 97

Высаливающая хроматография 1855 19,0 1,01% 11,1 66,0

Хроматография на

ДЕ-52 целлюлозе 872 15,3 1,8% 19,0 53,1

Гель-фильтрация на Сефадексе G-200 373 14,2 3,8% 41,2 49,3

Хроматография на

фенил-сефарозе CL-4B 194,7 12,5 6,4% 69,6 43,2

Хроматография на

голубой сефарозе 82,5 9,5 11,5% 125 33,0

Хроматография на

эстрадиол С-17-сефарозе 8,0 6,7 83,8% 907 7,81

Характеристика очищенного СБАГ представлена на рис.2, а очищенного транскортина вместе с маркерами молекулярной массы на рис.3.

Полученный нами препарат СБАГ не взаимодействовал с антисыворотками против сывороточных белков донора и против сывороточного альбумина и давал единственную дугу преципитации с поливалентной антисывороткой, полученной иммунизацией кроликов сывороткой беременных.

Методом диск-электрофореза препарат СБАГ выявлял только одну окрашенную полосу в зоне макроглобулинов (рис.2), а электрофорез полоски полиакриламидного геля во втором направлении с антисывороткой к сывороточным белкам беременной выявил единственный пик иммунопреципитата, принадлежащий СБАГ (рис.2).

По результатам SDS-ПААГ электрофореза препарат транскортина выявлял только одну окрашенную полосу в зоне между БСА (65 кД) и овальбумином (45 кД), соответствующую молекулярной массе 50-55 кД (рис.3).

Таблица. 7

Характеристика препарата транскортина на этапах выделения.

Этап очистки Cодержание белка, мг Cодержание

продукта % Степень очистки Выход (%)

Исходный материал 31200 26,0 0,08% 1 100

Надосадок (NH4)2SO4 40% насыщения 24400 25,0 0,10% 1,2 96

Высаливающая хроматография 4530 15,5 0,34% 4,1 60

Хроматография на

ДЕ-52 целлюлозе 688 10,7 1,56% 18,7 41,2

Осаждение (NH4)2SO4 60% насыщения (осадок) 79,3 9,2 11,6% 139,2 35,4

Хроматография на

фенил-сефарозе CL-4B 18,1 8,5 47% 583 32,7

Хроматография на

голубой сефарозе 5,3 4,2 79% 950 16,2

Оба препарата не проявляет иммунохимической активности при взаимодействии с антителами к ТБГ, ПЩФ, АФП и с большинством коммерческих антисывороток к белкам плазмы человека, а их антисыворотки не дает перекрестных линий преципитации между собой (рис.4).