DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 13.04.2008

Материалы

загрузка...

Морфологическая характеристика тканевой реакции при имплантации сетчатых эндопротезов

Дубова Елена Алексеевна, 13.04.2008

 

композитный

Vypro 0,39 - 25,0 3-4 мультифиламентный,

композитный

Vypro II 0,39 - 30,0 3-4 мультифиламентный,

композитный

Имплантацию полипропиленовых сетчатых эндопротезов под кожу на мышцы спины проводили в стерильных условиях и под общим обезболиванием (введение предбрюшинно 0,5 мл тиопентала натрия в разведении 1:10). При этом фиксации имплантанта не производилось, а на кожу накладывали отдельные узловые швы нитью Biosin 4/0. Животным контрольной группы имплантации сетчатых эндопротезов не производилось. На 3, 7, 14, 28 сутки после операции животных выводили из опыта и брали материал (ткань из области имплантации вместе с эндопротезом) для морфологического исследования. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с “Правилами проведения работы с использованием экспериментальных животных”.

Полученные кусочки ткани с имплантантом фиксировали в 10% нейтральном формалине. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином, по Ван Гизон. Иммуногистохимическое исследование экспрессии K-67 (BioGenex, 1:30) проводили по общепринятой методике на депарафинированных срезах толщиной 3 мкм, расположенных на стеклах, покрытых L-полилизином. Предварительную демаскировку антигена проводили путем кипячения образцов в растворе цитратного буфера рН 6,0. Блокирование эндогенной пероксидазы проводили путем обработки срезов 0,3% раствором перекиси водорода в течение 15 мин. В качестве фонового красителя использовали гематоксилин. Количественную оценку клеточного состава проводили при помощи телевизионного анализатора изображения “МЕКОС-Ц”. Статистическую обработку количественных данных проводили при помощи ЭВМ с использованием программы “Statistica”.

Для электронно-микроскопического исследования вырезали кусочки ткани размером приблизительно 1 мм3, фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида и 1% растворе четырехокиси осмия. Затем материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50, 70, 96 и 100%), после чего пропитывали в смеси окись пропилена – эпон-аралдитовая смола. После пропитки материал помещали в капсулы и заливали эпон-аралдитовой смесью, затем помещали в термостат при температуре 60оС на двое суток. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1,5–2 мкм. После этого срезы окрашивали толуидиновым синим. После предварительного светомикроскопического изучения полутонких срезов вырезали пирамидки с таким расчетом, чтобы поверхность среза приходилась на интересующий нас участок. Ультратонкие срезы толщиной 100-120 нм получали на ультратоме фирмы LKB (Швеция). Ультраструктурное изучение препаратов проводили при помощи электронного микроскопа Philips CM 10 (Нидерланды).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

При морфологическом изучении операционного материала больных с рецидивирующими грыжами установлено, что во всех исследованных наблюдениях (даже спустя 19 и 35 лет) в области эндопротезов имелись признаки хронического воспаления. В наблюдениях, когда эндопротез был удален в связи с рецидивом грыжи и не осложнялся развитием свищей и гнойного воспаления, вокруг синтетического материала отмечалось разрастание коллагеновых волокон с воспалительной инфильтрацией, содержащей гигантские многоядерные клетки типа инородных тел. Наиболее выраженная воспалительная реакция отмечалась при использовании эндопротеза из полиэтилентерефталата по сравнению с имплантатами из полипропилена.

На сроках 4 года, 6, 7, 9, 19 и 35 лет после имплантации эндопротеза из полиэтилентерефталата (лавсана) выявлялась соединительная ткань различной степени зрелости. Коллагеновые волокна ориентировались вокруг полифиламентных нитей сетчатого эндопротеза, а также врастали между волокнами, составляющими полифиламентную нить. Клеточная инфильтрация носила очаговый характер и была представлена преимущественно лимфоцитами, макрофагами. Выявлялись гигантские многоядерные клетки типа инородных тел. Следует отметить, что на сроках 19 и 35 лет гигантских клеток не наблюдалось. Наряду с этим, в образцах, взятых через 19 и 35 лет после имплантации сеток, мы выявили деструкцию полифиламентных нитей эндопротеза из полиэтилентерефталата, что, видимо, и явилось причиной рецидива грыжи. Кроме того, на этих сроках имелись явления выраженного гиалиноза тканей в зоне имплантации.

Сетчатые имплантаты, состоящие из полифиламентных нитей полиэтилентерефталата и полипропиленовых мононитей, после выделения из операционного материала значительно отличаются по внешнему виду и по микроскопической картине. Изученные нами разновидности полипропиленовых монофиламентных эндопротезов мало чем отличаются друг от друга, кроме характера плетения. Вероятно, поэтому и микроскопическая картина в прилежащих тканях после имплантации в целом идентична.

Во всех наблюдениях нам удалось по микроскопической картине определить полимерную основу эндопротеза, при этом марку эндопротеза удалось уточнить лишь по выписке об использованном во время предыдущей операции эндопротезе. Сложность идентификации марки эндопротеза также обусловлена исследованием преимущественно поперечных срезов эндопротезов. В то же время разница между полифиламентными нитями из полиэтилентерефталата и полипропиленовыми мононитями была очевидной.

В процессе исследования мы не выявили четких отличий в тканевой реакции на два различных по природе типа эндопротезов. Тем не менее, сетчатые эндопротезы из полиэтилентетрафталата вызывали образование более плотной соединительной ткани и более выраженную инфильтрацию многоядерными гигантскими клетками. Нити полипропилена окружены менее плотной соединительной тканью. Они биологически более инертны и вызывают, как правило, менее выраженную гигантоклеточную реакцию. Возможно, эта разница обусловлена больше структурными особенностями нитей, составляющих эндопротез, поскольку суммарная поверхность полимера при полифиламентной нити значительно больше поверхности монофиламентной нити при той же длине. Соответственно, при большей поверхности интенсивнее образуется соединительная ткань и более выражена реакция тканей. Кроме того, благодаря фитильным свойствам полифиламентной нити в ней и вокруг нее задерживается больше тканевой жидкости, фибрина, стимулирующих формирование более плотной соединительнотканной капсулы по сравнению с мононитями.

Гистологические признаки острого воспаления, такие, как нейтрофильные гранулоциты и некроз, выявлялись лишь на небольших участках сетчатого протеза. Коллагеновые волокна, прилежащие к сетчатому эндопротезу, были в основном, ориентированы параллельно нитям имплантата и в то же время прорастали в ячейки эндопротеза. В результате сетчатый эндопротез и соединительная ткань образовывали единое целое.

По данным B. Klosterhalfen с соавт. [1999] сетчатые эндопротезы из полиэтилентерефталата через несколько лет после имплантации разрушаются, что нами также отмечено на сроках 19 и 35 лет. Однако в других наблюдениях, когда сетчатые эндопротезы из полиэтилентетрафталата пришлось удалить в связи с хронической инфекцией или рецидивом грыжи, мы наблюдали структуру сетки, инкорпорированную в ткани. B. Klosterhalfen с соавт. [1999] считают, что имплантация аллопластических материалов, таких как дакроновые сосудистые протезы, повышает риск развития сарком. Однако случаев возникновения злокачественных новообразований, обусловленных использованием синтетических полимерных материалов для пластики брюшной стенки, не описано. Мы также среди оперированных больных не наблюдали признаков опухолевого роста в зоне имплантата.

Согласно данным литературы [Сурков Н.А. и др., 2004; Klinge U. et al, 1999; Novitsky Y.W. et al., 2008; Weyhe D. et al., 2008] выраженность тканевой реакции главным образом зависит от веса имплантируемого материала и размера его пор. Существующее разделение имплантатов на легкие (облегченные) и тяжелые основано на существенной разнице в их массе. Широкий диапазон современных сетчатых эндопротезов включает как простые сетки с пониженным содержанием полипропилена, куда входят рассасывающиеся волокна полиглактина или полиглекапрона, а также сетки с уменьшенным содержанием полипропилена с различными дополнительными покрытиями. Установлено, что для обеспечения лучшего прорастания тканями эндопротеза размер его пор должен составлять 75-100 µм или больше, так как крупные поры препятствуют возникновению и персистированию инфекции [Amid P.K. et al., 2001, Weyhe D. et al, 2007].

Преимущества сеток с крупными размерами пор заключаются в их влиянии на процесс образования коллагена. В эксперименте на животных при денситометрическом анализе установлено, что увеличение размера пор на 12 µм сопровождается образованием большего количества коллагена 1 типа [Greca F.H. et al., 2005]. Такое увеличение образования коллагена приводит к лучшим механическим результатам, а также лучшей организации и васкуляризации соединительной ткани, по сравнению с результатами, полученными при использовании сеток с малым размером пор.

Учитывая вышеизложенное, мы в экспериментах на животных проанализировали динамику тканевой реакции на тяжелые и облегченные композитные эндопротезы и установили, что имплантация мышам полипропиленовых эндопротезов сопровождается развитием преимущественно экссудативной воспалительной (через 3 и 7 суток) и затем фибропластической (через 14 и 28 суток) реакций. При этом при иммуногистохимическом и электронномикроскопическом исследованиях на ранних сроках эксперимента (3 и 7 суток) установлено повышение индекса пролиферации и преобладание клеток (макрофагов и фибробластов) в функционально активном состоянии в области расположения эндопротеза.

Среди тяжелых полипропиленовых сеток наиболее выраженная воспалительная реакция отмечается при имплантации эндопротезов «Эсфил» и «Biomesh P1 Mesh». При этом формирование соединительнотканной капсулы вокруг сеток происходило в одинаковые сроки. При использовании тяжелых полипропиленовых сеток отмечается более выраженная воспалительная реакция по сравнению с облегченными полипропиленовыми сетками. Имплантация облегченных композитных полипропиленовых сеток с более крупным размером пор характеризуется более выраженной фибропластической реакцией и более ранним формированием соединительнотканной капсулы вокруг эндопротеза по сравнению с тяжелыми полипропиленовыми сетками.

Согласно данным литературы, в аналогичных экспериментах на животных показано, что имплантаты с меньшим количеством синтетического материала сочетаются с лучшей интеграцией в ткани организма и меньшей реакцией на инородное тело [Сурков Н.А., 2007]. Имеются также указания, что выраженность процессов апоптоза и воспаления после имплантации облегченных сеток значительно ниже, чем при имплантации традиционных сеток [Junge K. et al., 2005]. При этом воспалительная и фибропластическая реакции наиболее выражены в ранние, а не отдаленные, сроки после имплантации сетки [Rosch R. et al., 2003].

По данным других исследователей, при изучении имплантат-индуцированного фиброза и образования внутрибрюшных сращений не выявлено различий между тяжелой полипропиленовой сеткой и облегченной сеткой Vypro II [Goldenberg A. et al., 2005]. Фактически фиброз был более выражен при использовании Vypro II, но его возникновение авторы интерпретируют с лучшей интеграцией в ткани организма. В других исследованиях на животных показано, что размер пор и структура сетки являются наиболее важными факторами для развития адекватной реакции тканей на их имплантацию [Weyhe D. et al., 2006]. Это означает, что сетки с крупными порами оказывают положительный эффект на васкуляризацию и характер вживления имплантата, что подтверждает результаты некоторых пионерских исследований о том, что крупные поры имплантата препятствуют развитию инфекции [Taylor D.F. et al., 1972].

В экспериментах на мышах нами выявлены определенные различия в динамике тканевой реакции на имплантацию сетчатого «Biomesh P1 2 Mesh» и нетканого «Biomesh NK2 Mesh» полипропиленовых эндопротезов. При имплантации нетканого эндопротеза выявлена более выраженная воспалительная реакция тканей. На основании морфометрического анализа нами установлено, что на 3-и сутки после имплантации нетканого эндопротеза количество нейтрофильных гранулоцитов было в 2,7 раза (р<0,05) больше, чем при использовании сетчатого протеза, при этом количество фибробластов было заметно больше при применении сетки (рис. 1). При этом врастание компонентов соединительной ткани между волокнами нетканого эндопротеза практически полностью отсутствует до середины второй недели после операции. Тем не менее, через 2 недели эксперимента вокруг нетканого эндопротеза на фоне умеренного содержания клеток воспаления уже формировалась соединительнотканная капсула с практически тотальным прорастанием имплантата компонентами соединительной ткани, в то время как при использовании сетчатого эндопротеза имелись лишь начальные признаки врастания соединительной ткани между волокнами имплантата. К концу эксперимента (28 суток) вокруг обоих эндопротезов преобладали фибробласты. Вокруг сетчатого имплантата нами отмечена широкая соединительнотканная капсула, большая часть ячеек которого также замещена соединительной тканью. В случае нетканого протеза соединительнотканная капсула заметно тоньше, а компоненты соединительной ткани тотально прорастали имплантат. Таким образом, несмотря на более выраженную воспалительную реакцию полное прорастание нетканого эндопротеза компонентами соединительной ткани и формирование фиброзной капсулы вокруг протеза возникает на более ранних сроках эксперимента, чем при использовании сетчатого эндопротеза.

Выявленные отличия в тканевой реакции, на наш взгляд, связаны с различным типом имплантируемых эндопротезов. Так, сетчатый эндопротез «Biomesh P1 Mesh» является вязаным тяжелым полипропиленовым имплантатом с поверхностной плотностью 100 г/м? и толщиной волокон 0,6 мм. Волокна нетканого эндопротеза «Cousin» («Biomesh NK 2 Mesh») соединены между собой особым образом в условиях термической обработки, не образуя переплетений и узлов, в отличие от сетчатого имплантата, волокна которого в процессе вязания сетки образуют узловые соединения. Такая структура нетканого протеза обеспечивает лучшее врастание компонентов соединительной ткани между волокнами имплантата и резистент-

а) нейтрофильные гранулоциты б) макрофаги

в) лимфоциты г) фибробласты

д) нейтрофильные гранулоциты е) макрофаги

ж) лимфоциты з) фибробласты

Рис. 1. Динамика изменения клеточных элементов в области имплантации тяжелых (а,б,в,г) и облегченных (д,е,ж,з) полипропиленовых сеток. По оси абсцисс – длительность эксперимента (сутки), по оси ординат – количество клеток в 10 полях зрения.

ность его к растяжению и деформации. Кроме того, количество полипропилена при изготовлении нетканого эндопротеза снижено до 35 г/м? а толщина его волокон составляет всего 0,25 мм, что также влияет на характер тканевой реакции.

Имплантация большинства сетчатых эндопротезов вызывает развитие острого или подострого воспаления с умеренным отеком и инфильтрацией полиморфноядерными лейкоцитами и макрофагами в течение 1-3 недель [Klosterhalfen B. et al., 2002]. В наибольшей степени эти изменения выражены через 14–21 день, затем они переходят в более или менее выраженное хроническое воспаление, окружающее инородное тело. Одновременно с этим формируется богатая коллагеновыми волокнами рубцовая ткань, образующая трехмерную структуру вокруг и внутри сетчатого имплантата. При этом число фибробластов и уровень васкуляризации обратно коррелируют с длительностью воспалительной реакции, тогда как выраженное острое воспаление на начальных этапах имплантации вызывает образование значительного количества фиброзной ткани [Саркисов Д.С. и др., 1989].

По мнению R. Rosch с соавт. [2003] наиболее важными факторами, влияющими на биосовместимость с инородными материалами, являются интенсивность и продолжительность воспалительной реакции и процессов заживления, зависящие в свою очередь от типа материала. Выраженность воспалительной реакции в ответ на внедрение биоматериала в организм влияет в итоге на «вживление» эндопротеза в зоне имплантации.

Другим важным параметром полипропиленовых сеток является структура их волокон. Сетки могут быть подразделены на монофиламентные и мульти(поли)филаментные, с наличием или без рассасывающегося компонента, имеющие дополнительное покрытие или нет.

В результате проведенного нами сравнительного исследования установлено, что имплантация мультифиламентных сеток «Vypro» и «Vypro II» сопровождается более выраженной и длительной воспалительной реакцией с большим содержанием нейтрофильных гранулоцитов в отличие от монофиламентной облегченной композитной сетки «Ultrapro». Так на 3-и сутки эксперимента количество нейтрофильных гранулоцитов при использовании сеток «Vypro» было в 2,8 раза больше, а в случае с сеткой «Vypro II» в 3,6 раза по сравнению с исследованиями эндопротеза «Ultrapro» (p<0,05). Степень же выраженности фибропластической реакции при использовании этих сеток практически одинакова.

В литературе имеются указания, что со временем между волокнами мультифиламентных сеток проникает большое количество микроорганизмов [Amid P.K. et al., 1994]. В то же время, в исследованиях in vitro показано увеличение роста фибробластов человека при их инкубации в присутствии мультифиламентной сетки [Langer C. et al., 2005].

Таким образом, менее выраженные воспалительная реакция и фиброз, микроскопические признаки нормального заживления и лучшая интеграция в окружающие ткани отмечаются при имплантации эндопротезов с бoльшим размером пор, меньшим объемом полипропиленового компонента и монофиламентными волокнами. В нашем исследовании такими характеристиками обладала сетка «Ultrapro».

Анализируя данные литературы по изучаемой проблеме, следует отметить, что в последние время все большее внимание придается использованию полипропиленовых эндопротезов с различными покрытиями с целью предотвращения развития осложнений. В основном эти покрытия используют для предотвращения развития спаечного процесса. Так, имеются указания на то, что предварительное покрытие полипропиленовых эндопротезов коллагеном [Duffy A. J. et al., 2004, Van't Riet M. et al., 2004], ?-глюканом [Barrat C. et al., 2004], коллагеном карбокси-метилцеллюлозой [Yelimlies B. et al., 2003] сопровождается значительно менее выраженным спайкообразованием и лучшей интеграцией имплантата в ткани брюшной стенки. Однако при этом более часто развиваются инфекционные осложнения. Показано, что титановое покрытие оказывает положительный иммунологический эффект на процесс заживления ран и интеграцию имплантата в ткани [Junge K. et al., 2005].

В этой связи нами проведено сравнительное изучение тканевой реакции на имплантацию интактных и покрытых фибробластами полипропиленовых сеток.

При сравнительном изучении динамики клеточной реакции на имплантацию полипропиленовых сетчатых эндопротезов «Prolene», «Эсфил», «Surgipro Mesh SPMМ» и «Biomesh P1 Mesh», покрытых фибробластами выявлено, что на ранних сроках эксперимента наиболее выраженная воспалительная реакция отмечается в зоне имплантации сеток «Surgipro Mesh SPMМ» и «Biomesh P1 Mesh». При этом клеточная реакция носила нейтрофильно-макрофагальный характер, при использовании эндопротеза «Prolene» – макрофагально-лимфоцитарный, а при применении сетки «Эсфил» – лимфоцитарно-макрофагальный характер воспаления.

В результате проведенного нами морфометрического анализа препаратов установлено, что на 3-и сутки эксперимента наименьшее количество нейтрофильных гранулоцитов отмечается при использовании сетки «Эсфил» (рис. 2). В случае с эндопротезом «Prolene» их было больше в 1,5 раза (р<0,05), при применении сетки «Biomesh P1 Mesh» – в 3 раза (р<0,01), при имплантации протеза «Surgipro Mesh SPMМ» – в 5 раз больше (р<0,01). В целом на этом сроке наименее выраженная воспалительная реакция выявлена при имплантации сетчатого эндопротеза «Prolene», а наиболее выраженная - при использовании эндопротезов «Эсфил» и «Surgipro Mesh