DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 04.04.2011

Материалы

загрузка...

Ферментативная регуляция SS/SH редокс статуса запасных белков и качества клейковины пшеницы

Осипова Светлана Владимировна, 04.04.2011

 

60 225.9 ± 4.6 202.9 ± 7.5*** 258.2 ± 2.0** 408.5 ± 15.0***

Приведены средние значения из трех аналитических повторностей. * - достоверность различий с содержанием SH групп в нулевой точке. ** - P < 0.01; *** - P < 0.001.

В реакционной среде, содержащей белки клейковины и GSH (3), количество SH групп за 60 мин инкубации увеличилось на 7.7 %. Дополнительное внесение ферментного экстракта (4) привело к существенному (в 6.2 раза) возрастанию скорости реакции, в результате за 60 мин инкубации количество SH групп увеличилось на 39.6 %.

Данные, представленные в этом разделе, свидетельствуют, что в созревающей зерновке пшеницы присутствуют ферментные системы, катализирующие как окисление белковых SH групп, так и редукцию SS связей белков клейковины. Для функционирования тиолоксидазы не требовались низкомолекулярные кофакторы, однако в анаэробных условиях активность не проявлялась. Активность ТПДО проявлялась только в присутствии GSH, что характерно для GSH- зависимых протеиндисульфид оксидоредуктаз (ТПДО, КФ 1.8.4.2), известных в различных животных тканях (Varandani, 1973; Carmichael et al., 1979).

Активность тиолоксидазы, дисульфидредуктазы, содержание SS связей и SH групп в развивающихся зерновках пшеницы сорта Скала. Динамика активности дисульфидредуктазы в зерне разнокачественных сортов пшеницы

Из данных рисунка 1А, видно, что максимум активности ТПДО в зерне пшеницы сорта Скала проявлялся в конце молочной- начале восковой спелости зерновок (содержание воды 55 - 45 %) с последующим снижением ее к концу созревания. Тиолоксидазная активность была достаточно высокой в течение всего периода созревания зерна от ранней молочной до полной спелости (Рис. 1А). В период восковой спелости в зерновках возрастало соотношение активностей ТО/ТПДО (Рис. 1С), одновременно увеличивалось суммарное количество SS связей (Рис. 1В) и соотношение SS/SH (Рис. 1С). В период с конца молочной (55 % влажность) до полной спелости отношение активностей ТО/ТПДО и баланс SS/SH в зерновках были связаны тесной положительной корреляционной связью (r = 0.90, P < 0.05). Эти данные свидетельствуют о вовлеченности ферментов в регуляцию SS/SH статуса белков зерновки.

Рисунок 1. ТО и ТПДО (А) активности (мкмоль SH/мин/мг белка * 10 ? ?), содержание SS-связей и SH-групп (В), отношение активностей ТО/ТПДО и SS/SH (С) в созревающих зерновках пшеницы сорта Скала. Представлены средние значения из трех независимых опытов.

На рисунке 2 отображена динамика активности ТПДО в развивающихся зерновках шести сортов яровой пшеницы разного качества и скороспелости (Osipova et al., 2007). В этом опыте пшеницу выращивали в течение двух лет в полевых условиях в окрестностях Иркутска. Активность ТПДО у сортов в независимых экспериментах различалась, однако динамика активности для каждого сорта была сходной. У большинства сортов активность ТПДО в зерновках достигала максимума на третьей и четвертой неделях после цветения, в последующем снижалась в разной степени у различных сортов. Эти данные показывают, что в период максимального синтеза белков клейковины, который начинается со второй недели после цветения (Grunwade et al., 1996), и интенсивного образования надмолекулярных структур глютенина (Abonyi, 2010) в зерновке высока активность ТПДО, катализирующей разрушение белковых дисульфидов. В тот же период развития зерновки, как было установлено Every и соавторами (2006), в зерновке высока активность протеин дисульфид изомеразы, катализирующей изомеризацию дисульфидных связей белков. Начиная с ранней молочной спелости и на протяжении всего периода созревания в зерновке активна тиолоксидаза (Рис. 1). Эти данные свидетельствуют, что редокс окружение в клетках эндосперма в период синтеза запасных белков и формирования полимеров клейковины определяется балансом как низкомолекулярных редокс агентов, так и активности эндогенных оксидоредуктаз, способных регулировать интенсивность полимеризации запасных белков.

Рисунок 2. Активность ТПДО (мкмоль SH/мин/зерновка * 10??) и содержание воды (%, гистограммы) в развивающихся зерновках пшеницы сортов: а) Лютесценс 616Н5, б) Эритроспермум 674Н27, в) Дружина, г) Скала, д) Пиротрикс 28/14, е) Свободар

Представлены результаты определения активности ТПДО как среднее значение из двух повторностей в рамках одного независимого эксперимента ± ошибка средней.

Взаимосвязь активностей тиолоксидазы и дисульфидредуктазы с качеством клейковины в зерновках яровой мягкой пшеницы сибирской и кубанской селекции

Наиболее чувствительными к изменениям структуры глютениновых полимеров являются реологические тесты, которые используют в качестве индикаторов состояния макромолекулярных белковых комплексов

(Dobraszczyk and Morgenstern, 2003). Показатели альвеографа и фаринографа, использующиеся в технологических лабораториях для оценки качества клейковины, хорошо отражают реологические (альвеограф) и смесительные (фаринограф) свойства теста.

Чтобы установить взаимосвязь активности эндогенных ТПДО и ТО с физическими свойствами клейковины от 7 (в Иркутске) до 15 (в Краснодаре) сортов яровой мягкой пшеницы были выращены в период с 1986 по 1988 годы в разных почвенно-климатических условиях на опытных полях Иркутского НИИСХ и Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко. Умеренно-континентальный климат Краснодарского края благоприятен для возделывания зерновых, а в Предбайкалье созревание зерна происходит при постоянном нарастании дефицита тепла, который в фазе восковой спелости достигает 10°С (Илли, 2010). Всего в этой серии экспериментов были проанализированы технологические характеристики 78 образцов зерна мягкой пшеницы.

Анализ генотипической вариабельности параметров качества зерна и клейковины показал, что содержание белка и клейковины у пшениц, выращенных как в Краснодаре, так и в Иркутске, характеризовались незначительной вариабельностью (коэффициент вариации V – от 1.5 до 5 %).

Генотипическая вариабельность показателей, характеризующих физические свойства клейковины, была средней как в условиях Иркутска, так и в условиях Краснодара (коэффициенты вариации для различных показателей составляли от 5 до 22%).

Модификационная изменчивость содержания белка и клейковины также была незначительной, и для всех изученных сортов пшеницы коэффициенты вариации этих показателей не превышали 10 % (Табл. 2). По объемному выходу хлеба наиболее стабильными оказались сорта Скала (V = 1.9%) и Пиротрикс 28/14 (V = 3.6 %), у других сортов коэффициенты вариации колебались в пределах 13 – 17 %. Необходимо отметить, что лабораторные выпечки производили только из муки пшеницы, выращенной в Краснодаре.

В то же время показатели качества теста характеризовались значительной модификационной изменчивостью. Коэффициенты вариации для устойчивости теста составили у разных сортов от 11 до 56 %, для разжижения теста – от 20 до 54 %. По валориметрической оценке коэффициенты внутрисортовой изменчивости у разных сортов колебались от 5 до 19 %. Столь же значительной модификационной изменчивостью характеризовались активность тиолоксидазы (V = от 8 до 49 %) и дисульфидредуктазы (V = от 7 до 67 %) в зерне на стадии поздней молочной спелости.

Сравнение по t-критерию (Табл. 3) показателей качества для семи сортов, выращенных в разных географических регионах и представленных в таблице 2, показало, что в условиях Иркутска существенно снижалось время образования и устойчивости теста, валориметрическая оценка и более чем в 3 раза возрастало разжижение теста. Анализ активности ферментов в зерне тех же сортов на стадии поздней молочной спелости выявил, что в Иркутске была снижена тиолоксидазная активность, повышена активность ТПДО, и более чем в два раза снижено отношение активностей ТО/ТПДО (Табл. 3).

Приведенные данные не только отражают высокую модификационную изменчивость удельной активности ферментов и фаринографических показателей качества теста, но и свидетельствуют о существовании вполне определенной взаимосвязи между ними. Корреляционный анализ дает Таблица 2. Изменчивость активности ТО и ТПДО (Е/мг * 10 ? ?) и показателей качества у отдельных сортов пшеницы в разных условиях выращивания (стационары КНИИСХ и ИрНИИСХ, 1986-1988 гг)

Сорт Удельная активность ферментов Мука Тесто Хлеб

ТО/ТПДО

Белок, %

Клейковина, % Устойчи-вость, мин Разжиже-ние, е.ф. Вало-риметр, е.ф. Объем-ный выход Общая хл.-пек. оценка, баллы

Светояр

Лютесценс 615Н5

Свободар

Эритроспермум 674Н5

Пиротрикс 28/14

9.5 ± 2.1

7.1 ± 2.0

9.7 ± 0.8

8.1 ± 1.5

4.7 ± 2.3

7.2 ± 2.2

7.6 ± 1.1

14.5 4.0 ± 1.5

3.0 ± 0.5

2.9 ± 0.2

2.0 ± 0.3