DisCollection.ru

Авторефераты и темы диссертаций

Поступления 02.01.2009

Материалы

загрузка...

Биохимические особенности ингибирования меланогенеза шерсти у овец

Косимов Раджабек Бобораджабович, 02.01.2009

 

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер NCC2 в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

Вместе с тем реактивирующий эффект клеток NCC2 не превышал таковой в клетках NIH3T3: индекс реактивации через 24 ч варьировал от 12 до 36%.

Гетерокарионы «клеток SV3T3 + клетки меланосомы». Клетки SV3T3, полученные в результате трансформации клеток 3Т3 Balb\c вирусом SV40, являются высокозлокачественными.

Рис. 6. Синтез ДНК в гетерокарионах меланосомы и клеток SV3T3 (24 часа после слияния). Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер SV3T3 в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

По сравнению с другими клетками они оказались в наименьшей степени подвержены ингибирующему действию клеток меланосомы.

Индекс подавления синтеза ДНК в гетерокарионах был через 24 ч не более 23%. Низкая чувствительность злокачественных клеток SV3T3 к ингибирующему эффекту клеток меланосомы могла объясняться тем, что эти клетки обладают чувствительностью к ингибиторам из SV3T3 лишь в короткий отрезок времени в начале G1- периода. Вместе с тем индекс реактивации клеток меланосомы в этот же срок был весьма высоким –от 35 до 70%. В то же время, индексы реактивации были существенно ниже, чем в гетерокарионах с асинхронными SV3T3: 14-34%. Итак, малигнизация клеток, вызванная онкогенным вирусом SV40 или онкогеном c-Ki-ras, приводит к резкому снижению или исчезновению чувствительности клеток к подавляющему эффекту клеток меланосомы.

Таблица 1. Синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы и предварительно синхронизованных клеток SV3T3 в гетерокарионах

Срок после слияния (ч) Число исследованных ГК Доля меченых ядер SV3T3 в ГОм окарионах, (%). Доля меченых среди неслившихся ядер SV3T3 (%). Доля меченых ядер SV3T3 в ГК (%). Индекс подавления синтеза ДНК в SV3T3 в ГК (%). Индекс реактивации ядер меланосом ГК (%).

24 93 89,3±1,8 93,7±1,4 84,1±1,6 8,6 33,7

24 64 87,0±1,0 92,5±1,6 90,6±1,3 2,0 22,4

24 103 87,2±1,0 92,2±1,7 78,6±1,0 14,7 13,6

24 193 89,6±1,6 98,2±1,3 73,6±1,3 25,0 26,0

Вместе с тем способность реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы выражена у малигнизированных клеток не в большей степени, чем у незлокачественных иммортализованных клеток.

Синтез РНК в гетерокарионах «эмбриональный фибробласт

овец + клетки меланосомы»

Негативный эффект клеток меланосомы на репликацию в ядрах клеток-партнеров мог быть вызван неспецифическим подавлением транскрипционной активности последних и, как следствие, нарушением подготовки к S-периоду. Для проверки этой возможности изучили влияние ядер клеток меланосомы на транскрипцию в ядрах ЭФО в составе гетерокарионов. Для того, чтобы различия в содержании ДНК не вносили слишком большой разнобой при определении уровня транскрипции в ядрах, для слияния с клетками меланосомы использовали синхронизованные ЭФО. В культуре фибробластов, достигшей монослоя, меняли полную культуральную среду на среду с 0,25% сыворотки и инкубировали ее затем в течение пяти суток. Покоящиеся клетки сливали с клетками меланосомы с помощью электроимпульса при центрифугировании.

Рис. 7. Синтез РНК в ядрах ЭФО в гетерокарионах с клетками меланосомы.

П р и м е ч а н и е: по оси абсцисс – количество зерен серебра на ядро ЭФО, по оси ординат - % ядер ЭФО

Известно, что при переходе в покой ЭФО задерживаются в G1 - периоде и содержание ДНК в их ядрах соответствует диплоидному. После слияния клетки переводили в полную среду, помещали в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами и инкубировали в течение двух часов при температуре 37о, с тем чтобы они прикрепились и распластались, после чего добавляли на 15 мин 10 мкКи\мл 3Н-уридин. Через 15 мин. клетки фиксировали смесью этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 и подвергали авторадиографической обработке. Подсчитывали количество зерен над ядрами ЭФО в гетерокарионах и в моноядерных неслившихся клетках.

Среднее число зерен на ядро составляло для гетерокарионов 86,5±2,6, а для неслившихся клеток-83,5±2,1. Таким образом, оказалось, что клетки меланосомы существенно не влияют на транскрипцию в ядрах ЭФО.

Результаты исследования транскрипции в гетерокарионах ЭФО+клетки меланосомы приведены на рис. 6.

Кариобриды «эмбриональный фибробласт овцы + кариопласт клеток меланосомы». Ядра клеток меланосомы отличаются высокой степенью конденсации хроматина. Можно было предположить, что ядерные белки, ответственные за инактивацию генома клеток меланосомы, вызывают обнаруженное нами подавление синтеза ДНК в гетерокарионах. В связи с этим предстояло выяснить, где, в ядре или в цитоплазме клеток меланосомы, локализованы факторы, подавляющие синтез ДНК в гетерокарионах. Для ответа на этот вопрос клетки меланосомы энуклеировали с помощью цитохалазина В, путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла по Wigler M.H. and Weinstein J. B. (1995). Полученные кариопласты клеток меланосомы содержали ядра, окруженные лишь тонким ободком цитоплазмы. При слиянии кариопластов клеток меланосомы с ЭФО через 24 ч не было обнаружено подавления синтеза ДНК в образующихся кариобридах.

Рис. 8. Синтез ДНК в кариобридах ЭФО + кариопласт меланосомы

(24 часа после слияния).

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер ЭФО в неслившихся клетках культуры (1), в кариобридах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3) по оси ординат время посте слияния.

Полученные результаты позволяют считать, что негативные регуляторы синтеза ДНК локализованы не в ядре, а в цитоплазме клеток меланосомы.

Исследование влияния предобработки клеток меланосомы ингибитором синтеза белка на их способность подавлять репликацию в гетерокарионах. В литературе имеются данные (Rabinovich P. S. and Norwood T.H., 1990) о том, что предобработка стареющих фибробластов человека ингибитором синтеза белка-циклогексимидом -резко снижает ингибирующий эффект этих клеток на синтез ДНК в ядрах молодых фибробластов в гетерокарионах. Был сделан вывод, что негативные регуляторы синтеза ДНК из фибробластов скорее всего являются белками. В связи с этим появилась необходимость провести аналогичные опыты на гетерокарионах с клетками меланосомы.

Рис. 9. Влияние предобработки клеток меланосомы ингибитором синтеза белка на их способность подавлять репликацию в гетерокарионах.

Примечание. По оси абсцисс доля меченых ядер ЭФО в неслившихся клетках культуры (1), в гетерокарионах (2), индекс реактивации в ядрах меланосомы (3), по оси ординат время посте слияния.

После обычной процедуры очистки клетки меланосомы инкубировали в течение 4 ч при 37о в полной культуральной среде с 5 мкг\мл циклогексимида. (В контроле проводили аналогичную инкубацию, однако в этом случае среда не содержала циклогексимида). Затем клетки отмывали от циклогексимида и сливали с асинхронными ЭФО. Оказалось, что предобработка клеток меланосомы циклогексимидом снижала более чем в 2 раза ингибирующий эффект клеток меланосомы на синтез ДНК в ядрах ЭФО. Полученные данные позволяют, сделать вывод, что ингибиторы репликации из клеток меланосомы имеют белковую природу и постоянно синтезируются в клетки меланосомы.

Опыты с кариобридами отчетливо указывают на цитоплазматическую локализацию негативных регуляторов в клетках меланосомы. Подавляющий эффект клеток меланосомы на репликацию в гетерокарионах не связан со снижением общей транскрипционной активности в ядрах клеток-партнеров. По–видимому, если он и опосредован снижением экспрессии генов, то только определенных, ответственных за подготовку клеток к S- периоду. Наличие негативных регуляторов в терминально дифференцированных клетках может быть обнаружено путем их слияния с активно пролиферирующими клетками-партнерами и последующего анализа репликации в образующихся гетерокарионах. Ранее другим автором в такого рода опытах in vitro было доказано, что факторы, предотвращающие репликацию, присутствуют в «стареющих» клетках и влияют на клетки находящихся в состоянии искусственно вызванного покоя фибробластах овец (Жилякова В.С., 2001).

Опираясь на результаты этих опытов, мы попытались идентифицировать негативные тормозящие регуляторы пролиферации клеток меланосомы, а также охарактеризовать кодирующие их гены. В литературе данные о блокировке пролиферации пигментных клеток, в частности клеток меланосомы очень

Большой интерес вызвало проведение частичных анализов регуляции синтеза ДНК в гетерокарионах, образованных активно пролиферирующими клетками и клетками меланосомы, полученными у овец наиболее светлой окраски шерсти. Известно, что у этих животных активность меланосомы уже почти подавлена.

Было установлено, что иммортализованные клетки, в отличие от клеток с ограниченной способностью к пролиферации, способны реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы, который мог быть связан с активацией онкогенов, ответственных за иммортализацию.

Известно, что онкогены семейства myc, кодирующие белки ядерной локализации и имеющих клеточное происхождение, способны при трансфекции «смертных» клеток иммортализовать последние. Очевидно, для того чтобы пролиферирующие клетки приобрели способность реактивировать синтез ДНК в ядрах клеток меланосомы, им необходимы продукты иммортализующих онкогенов.

Введение в клетки NIH3T3 ядерного онкогена v-mic повышало их реактивирующую способность вдвое. Вместе с тем трансформация NIH3T3 малигнизирующим онкогеном c-Ki-ras существенно не влияла на реактивацию синтеза ДНК в ядрах клеток меланосомы. ( Рис.4)

В гетерокарионах клеток меланосомы и клеток с ограниченной способностью к пролиферации (ЭФО) не было обнаружено достоверного снижения доли синтезирующих ДНК ядер клеток культур, по сравнению с неслившимися клетками (Рис.1).

Предстояло выяснить, блокируют ли клетки меланосомы уже идущий синтез ДНК или же только предотвращают вступление ядер клеток-партнеров в S –период. Клетки NIH3T3 переводили в состояние покоя, затем сливали с эритроцитами стимулировали к пролиферации сывороткой. Клетки меланосомы эффективно ингибировали вступление ядер клеток-партнеров в S–период. Ингибирующий эффект клеток меланосомы был выражен гораздо сильнее, чем в опытах с асинхронными клетками, особенно в случае клетками NIH3T3. В опытах по слиянию синхронных клеток NIH3T3 с клетками меланосомы синхронизацию проводили путем сбора метафаз после действия нокодазола, поскольку все эти клетки не переходят в состояние покоя. Слияние проводили через 2 ч после метафазы, когда клетки культур находились в G1. Однако в этом случае, как и в опытах с асинхронными клетками, не удалось обнаружить ингибирующего эффекта клеток меланосомы.

Исследование содержания эумеланина и феомеланина в шерсти овец различных пород и генотипов окраски

У овец довольно нелегко дифференцировать эумеланосомы и феомеланосомы. Нам не удалось оценить окраски меланосом под световым микроскопом (при увеличении в 1000-1500 раз). У овец большинства изученных нами генотипов гранулы меланина имеют черно-коричневую или коричневую окраску, соответствующую эумеланину, то есть присутствие феомеланина с помощью световой микроскопии часто не выявляется. При изучении содержания эумеланина и феомеланина в шерстном покрове ягнят было выявлено, что только ягнята черной и белой окрасок имеют действительно резко отличающихся результаты,по сравнению с другими группами животных.